Notch信號(hào)通路調(diào)控人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化的研究.pdf

1、目的：
　　用VEGF165誘導(dǎo)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells,hADSCs)向內(nèi)皮細(xì)胞分化，通過γ-內(nèi)分泌酶抑制劑（DAPT）對(duì)誘導(dǎo)分化進(jìn)行干預(yù)，檢測(cè)細(xì)胞的分化程度、Notch信號(hào)的表達(dá)、細(xì)胞遷移能力及成血管能力的變化，探究Notch信號(hào)通路在VEGF所誘導(dǎo)的hADSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化中的作用。
　　方法：
　　1、脂肪組織來源于遵義醫(yī)學(xué)院

2、附屬醫(yī)院整形外科住院的3例患者，經(jīng)病人同意并簽署知情同意書后，手術(shù)室無菌條件下收集標(biāo)本，采取器械剪切、酶消化及離心法提取hADSCs，用含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞并傳代，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志CD29、CD31、CD34及CD44的表達(dá)；取傳代至第3代的hADSCs,用VEGF165誘導(dǎo)其向內(nèi)皮細(xì)胞分化，14天后流式檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原的表達(dá)。
　　2、取傳代至第3代的hADSCs分為2組：對(duì)

3、照組：hADSCs；誘導(dǎo)組：hADSCs+50ng/mL的VEGF165。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法及Western bolt電泳法檢測(cè)兩組細(xì)胞培養(yǎng)至7天及14天時(shí)Notch1,Notch14及Dll4的mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　3、取傳代至第3代的hADSCs分為3組：對(duì)照組：傳至第三代的hADSCs；誘導(dǎo)組：hADSCs+VEGF165(50ng/mL)；干預(yù)組:VEGF165(50ng/mL)+hADSCs+DAPT（三個(gè)不同濃

4、度2.5ug/ml、10ug/ml、25ug/ml）；各組細(xì)胞培養(yǎng)至7天及14天后，分別用流式細(xì)胞儀檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞表面特異性抗原VE cadherin和CD31表達(dá)程度。用Transwell小室檢測(cè)上述細(xì)胞的細(xì)胞遷移能力。
　　4、取傳代至第3代的hADSCs分為3組，分組及處理情況同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，將上述三組細(xì)胞培養(yǎng)至7天和14天后，分別取約2×104個(gè)細(xì)胞移植于鋪好Matrigel基質(zhì)膠中的96孔板上，37℃培養(yǎng)箱中孵育6h后顯微

5、鏡拍照并分析體外血管生成能力。
　　5、取傳代至第3代的hADSCs分為3組，分組及處理情況同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，將上述三組細(xì)胞分別培養(yǎng)7天后，取各組對(duì)應(yīng)的新的細(xì)胞培養(yǎng)液和融化的Matrigel基質(zhì)膠混合，再與三組細(xì)胞分別混勻，植入裸鼠側(cè)肋部皮下，7天后頸椎脫臼處死裸鼠并取出種植的Matrigel膠，觀察膠內(nèi)血管生成情況，切片做CD31免疫化學(xué)染色，分析體內(nèi)血管生成能力。
　　結(jié)果：
　　1、從人的脂肪組織中分離出間充質(zhì)干細(xì)

6、胞，細(xì)胞形態(tài)多為梭形或星形，呈放射集落樣生長(zhǎng)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型分析表明，傳至第三代的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞表型CD29（96.31％）、CD44（98.91%）呈陽性表達(dá)，內(nèi)皮細(xì)胞表型CD31、CD34陰性表達(dá)；向內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)14天后CD31（88.38%）、CD34（92.81%）均呈陽性表達(dá)，而CD29、CD44的陽性表達(dá)率降低。
　　2、qPCR結(jié)果顯示：對(duì)照組和誘導(dǎo)組的細(xì)胞中Notch1、Notch4及Dll4的mRNA均

7、有表達(dá)，誘導(dǎo)組的相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，誘導(dǎo)組中誘導(dǎo)14天的相對(duì)表達(dá)量比7天的表達(dá)高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Western blot結(jié)果顯示：誘導(dǎo)組和對(duì)照組細(xì)胞中Notch1、Notch4及Dll4的蛋白均有表達(dá)，誘導(dǎo)組的蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，誘導(dǎo)組中14天的相對(duì)表達(dá)量比7天的表達(dá)高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　3、流式檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞表面特異性抗原VE-cadherin和CD31的陽性率的趨勢(shì)相同；對(duì)照

8、組陽性率最低，均低于1%；誘導(dǎo)組和干預(yù)組中14天的陽性率高于7天組；誘導(dǎo)組陽性率高于干預(yù)組；干預(yù)組中低濃度DAPT組的陽性率高于高濃度DAPT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，誘導(dǎo)組的細(xì)胞遷移能力最強(qiáng)，干預(yù)組次之，對(duì)照組細(xì)胞遷移能力最弱；誘導(dǎo)組和干預(yù)組中14天的細(xì)胞遷移能力較7天強(qiáng)，干預(yù)組中低濃度DAPT組的細(xì)胞遷移能力較高濃度組的遷移能力強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　4、體外基質(zhì)膠Matrige

9、l中的血管生成實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組中的細(xì)胞間成分離狀態(tài)，未見血管形成；誘導(dǎo)組可見形成閉合的多邊形結(jié)構(gòu)或形成復(fù)雜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；干預(yù)組中見較多細(xì)胞排列呈線，或少數(shù)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。誘導(dǎo)組的血管生成能力強(qiáng)于干預(yù)組；干預(yù)組中低濃度DAPT組的血管生成能力較高濃度組強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　5、三組細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)血管生成能力的強(qiáng)弱關(guān)系與體外血管生成實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，CD31免疫化學(xué)染色見形成的管腔內(nèi)壁有內(nèi)皮細(xì)胞著色，證實(shí)所成管網(wǎng)為血管網(wǎng)

10、；誘導(dǎo)組有大量管腔形成，干預(yù)組形成的管腔數(shù)少于誘導(dǎo)組，（P＜0.05）；干預(yù)組中，低濃度DAPT組的管腔數(shù)多于高濃度DAPT組，（P＜0.05）；對(duì)照組偶見管腔形成。
　　結(jié)論：
　　1、在hADSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化過程中，VEGF能上調(diào)Notch信號(hào)通路的表達(dá)。
　　2、阻斷Notch信號(hào)通路能抑制hADSCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化。
　　3、阻斷Notch信號(hào)通路能抑制hADSCs所分化成的內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力及在體內(nèi)