Notch通過BMPs-Smads信號通路促進間充質(zhì)干細胞的成骨分化.pdf

1、骨形態(tài)形成蛋白（bone morphogenetic proteins,BMPs）在機體發(fā)育過程中發(fā)揮多種作用，尤其在骨骼發(fā)育和骨形成過程中。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有20多種BMPs，其中BMP2，4，6，7和9具有促進間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）成骨分化的作用。目前BMP2，7已經(jīng)應用于美國等國家的骨相關疾病治療。但近年來研究發(fā)現(xiàn)BMP2，7臨床使用效果比預期差，臨床治療過程中常導致異位成骨、溶骨增加和

2、嚴重水腫等副作用。因此，尋找成骨作用更強的BMPs及促進BMPs成骨作用的信號通路，從而促進 MSCs和成骨BMPs在組織工程和再生醫(yī)學中的應用是目前相關領域基礎研究的熱點之一。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Notch在骨發(fā)育及重建中發(fā)揮重要的作用。我們前期的研究表明Notch信號促進BMP2，9誘導MSCs的成骨分化。那么Notch信號對其他的成骨相關BMPs（4/6/7）誘導成骨分化的作用如何？Notch信號促進BMPs成骨作用是否相同？其發(fā)揮促進B

3、MPs成骨作用的機制如何？本研究擬針對上述問題，探討Notch信號對BMPs誘導成骨作用的廣泛性，并對其可能的機制進行研究，繼而為 BMPs的臨床應用提供實驗依據(jù)。
　　第一部分：
　　目的：探討Notch信號對成骨BMPs誘導MSCs成骨分化的廣泛性。
　　方法：應用顯性負性突變型Notch1腺病毒（Ad-dnNotch1）或γ-分泌酶抑制劑DAPT下調(diào)Notch信號，用DLL1腺病毒（Ad-DLL1）激活Notch

4、信號。用堿性磷酸酯酶（alkaline phosphatase，ALP）染色及活性檢測成骨早期指標ALP和茜素紅S染色對晚期成骨指標鈣鹽進行檢測，并通過 RT-PCR檢測成骨相關基因ALP、Runx2、Col1a1的變化。
　　結(jié)果：dnNotch1明顯抑制了BMPs（4/6/7）誘導的早期成骨分化指標ALP。DAPT抑制了BMPs（4/6/7）誘導的早期成骨分化指標 ALP和晚期成骨指標鈣鹽沉積及成骨相關基因的表達，且DAPT抑

5、制作用呈劑量依賴性。DLL1顯著促進BMPs（4/6/7）誘導的早期成骨指標ALP和晚期成骨指標鈣鹽沉積及成骨相關基因的表達。DAPT對BMP2/4/6/7/9誘導的ALP都有抑制作用，但抑制率沒有明顯差異。
　　結(jié)論：Notch信號促進BMPs（4/6/7）誘導的MSCs成骨分化作用，結(jié)合前期在BMP2/9中的結(jié)果，Notch信號促進所有已知成骨BMPs誘導的MSCs成骨分化。
　　第二部分：
　　目的：探討Notc

6、h信號促進成骨BMPs誘導的MSCs成骨分化的分子機制。
　　方法：利用DAPT抑制Notch信號和Ad-DLL1激活Notch信號。首先，用Western blot和免疫細胞化學染色（immunocytochemistry，ICC）檢測DAPT和Ad-DLL1對BMPs的經(jīng)典信號通路中的Smad1/5/8的蛋白磷酸化水平和細胞內(nèi)定位的影響。其次，采用q-PCR檢測Notch信號對BMPs信號通路中發(fā)揮重要作用的受體ALK2基因水

7、平的影響。最后，流式細胞術(shù)分析細胞周期的變化。
　　結(jié)果：Western blot結(jié)果表明，DLL1可以促進成骨 BMPs誘導p-Smad1/5/8的蛋白表達而對總的Smad1/5/8的蛋白表達沒有明顯的影響。DAPT抑制BMPs誘導p-Smad1/5/8的蛋白表達而對總的Smad1/5/8的蛋白表達沒有明顯的影響。ICC實驗結(jié)果表明，DLL1促進BMPs誘導的p-Smad1/5/8在細胞核內(nèi)表達，而 DAPT抑制BMPs誘導的p

8、-Samd1/5/8在細胞核內(nèi)表達。q-PCR的結(jié)果表明，DLL1促進BMPs誘導的ALK2的基因表達，而DAPT抑制BMPs誘導的ALK2的基因表達。流式細胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）分析結(jié)果顯示，單獨的DLL1和BMPs對細胞的周期沒有明顯的影響，而DLL1和BMPs共處理后細胞的增殖周期G2+S期的比例明顯增加。DAPT和BMPs共處理后細胞的增殖周期G2+S期的比例明顯降低。
　　結(jié)論：Notch信號通過影

9、響B(tài)MPs/Smads信號通路及細胞的早期增殖促進MSCs成骨分化，而這一過程與Notch調(diào)控BMPs受體ALK2密切相關。
　　第三部分：
　　目的：Notch調(diào)控ALK2促進BMPs誘導的MSCs成骨分化的具體機制。
　　方法：用DAPT抑制Notch信號，Ad-ALK2和Ad-Hey1上調(diào)ALK2和Hey1，Ad-dnALK2下調(diào)ALK2的表達。ALP染色和活性分析檢測成骨分化指標ALP。q-PCR檢測基因ALK

10、2和Hey1的表達。
　　結(jié)果：ALP染色和活性分析結(jié)果表明，dnALK2可以抑制 BMPs（2/4/6/7/9）誘導的成骨分化。ALK2可以逆轉(zhuǎn)DAPT對BMPs誘導成骨分化的抑制作用。Hey1也可以逆轉(zhuǎn)DAPT對BMPs誘導成骨分化的抑制作用。q-PCR結(jié)果表明，Notch可以促進BMPs介導的基因Hey1的表達。Hey1也可以逆轉(zhuǎn)DAPT對BMPs介導的基因ALK2的抑制作用。生物信息學分析結(jié)果表明，ALK2基因的啟動子上有