葉酸對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞Notch和MAPK信號(hào)通路相關(guān)基因及蛋白表達(dá)作用的研究.pdf

1、目的:研究葉酸對(duì)大鼠胎鼠、新生鼠神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcells，NSCs)增殖分化中Notch和MAPK信號(hào)通路相關(guān)基因及蛋白表達(dá)作用的機(jī)制。 方法:采用孕14-16dSD胎鼠及24h內(nèi)同窩新生鼠全腦，進(jìn)行NSCs原代培養(yǎng)。在正常培養(yǎng)條件下，分為4組：①對(duì)照組；②葉酸缺乏組，添加甲氨蝶呤為0.4μg/ml；③葉酸低劑量組，添加葉酸為4μg/ml；④葉酸高劑量組，添加葉酸為40μg/ml。在加入MAPK通路抑制劑U01

2、26的條件下，分為4組：①對(duì)照組：②U0126組，只添加U0126為10μM；③U0126+低劑量葉酸組，添加U0126為10μM同時(shí)添加葉酸為4μg/ml；@U0126+高劑量葉酸組，添加U0126為10μM同時(shí)添加葉酸為40μg/ml。增殖第6d收集一半細(xì)胞，另一半加入含血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)6d，誘導(dǎo)細(xì)胞分化，第13d收集分化的細(xì)胞。葉酸、甲氨蝶呤等試劑均用培養(yǎng)液配制。首先按正常條件培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞，每次換液加入葉酸時(shí)即加入10μM的U

3、0126。采用克隆、酶切與測(cè)序等方法對(duì)RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定；采用實(shí)時(shí)定量SYBRCreenI-PCR方法，測(cè)定NSCsMAPK信號(hào)通路相關(guān)基因(ERK1、ERK2)mRNA表達(dá)情況；采用WesternBlot方法，正常培養(yǎng)條件下Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白(Notch1、HES5、Neurogeninl)的表達(dá)情況和加入MAPK通路抑制劑U0126條件下，該通路中相關(guān)蛋白(pERK1、pERK2)的表達(dá)情況。 結(jié)果:1、普通R

4、T-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)克隆、酶切、測(cè)序顯示，特異性好，擴(kuò)增片段與預(yù)期結(jié)果相符。 2、SYBRCreenI-PCR結(jié)果顯示，在加入MAPK通路抑制劑U0126的條件下，葉酸對(duì)胎鼠增殖期NSCsERK1/2mRNA表達(dá)的影響各組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；葉酸對(duì)新生鼠增殖期NSCsERK1/2mRNA表達(dá)的影響，某些組間雖有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但沒(méi)有一定的規(guī)律，體現(xiàn)不出葉酸的作用。 3、WesternBlot方法對(duì)J下常培養(yǎng)條件

5、下Notch信號(hào)通路和加入MAPK通路抑制劑U0126條件下該通路中相關(guān)蛋白進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示：(1)Notch通路增殖補(bǔ)充葉酸能夠促進(jìn)NSCsNotch1、HES5蛋白的表達(dá)(P<0.05)，分化晚期補(bǔ)充葉酸能夠降低Neurogenin1蛋白的表達(dá)(P<0.05)，同時(shí)也能增加HES5蛋白的表達(dá)(P<0.05)。(2)MAPK通路無(wú)論增殖期分化期，葉酸對(duì)胎鼠及新生鼠NSCspERK1、pERK2蛋白表達(dá)的影響均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.

6、05)。 結(jié)論:1、在正常培養(yǎng)條件下，葉酸可能通過(guò)上調(diào)增殖期胎鼠、新生鼠NSCsNotch信號(hào)通路中Notch1、HES5蛋白的表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖；而在NSCs的分化晚期，葉酸再一次上調(diào)HES5蛋白的表達(dá)，下調(diào)Neurogenin1蛋白的表達(dá)，促進(jìn)NSCs向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化。 2、在加入MAPK通路抑制劑U0126條件下，葉酸對(duì)增殖期胎鼠、新生鼠NSCsERK1/2mRNA的表達(dá)影響不明顯：對(duì)增殖分化期胎鼠、新生鼠

7、NSCspERK1、pERK2蛋白的表達(dá)影響也不明顯。 3、在正常培養(yǎng)條件下，葉酸40μg/ml劑量組與4μg/ml劑量對(duì)胎鼠、新生鼠NSCs的增殖分化中Notch通路中相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)作用基本一致；同樣，在加入MAPK通路抑制劑U0126條件下，這兩個(gè)劑量組對(duì)胎鼠、新生鼠NSCs的增殖分化MAPK通路中相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用也基本一致。 因此，葉酸可能通過(guò)影響Notch和MAPK信號(hào)通路中相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)從而促進(jìn)NS