南瓜蛋白對骨髓瘤RPMI8226細胞作用和Notch信號通路相關(guān)機制探討.pdf

1、目的：應(yīng)用高效、低毒的天然活性藥物南瓜蛋白(Cucurmosin,CUS)對骨髓瘤RPMI8226細胞體外增殖作用實驗、凋亡檢測及Notch相關(guān)信號通路的研究，初步探討CUS對RPMI8226增殖、凋亡等機制，為CUS治療MM提供理論依據(jù)。
　　方法：采用MTT法檢測CUS對體外培養(yǎng)的RPMI8226細胞增殖抑制作用（量效和實效）；胎盤藍拒染法計數(shù)活細胞繪制生長曲線，測定CUS對RPMI8226細胞增殖能力的影響；集落增殖抑制試驗

2、測定CUS對PRMI8226細胞的體外增殖抑制作用；透射電鏡觀察CUS作用后的細胞超微結(jié)構(gòu)；Annexin V/PI雙染流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡；PI單染流式細胞術(shù)DNA倍體分析；Western blot檢測CUS作用PRMI8226細胞后凋亡相關(guān)蛋白bcl-2和casepase-3、casepase-8、casepase-9等表達水平的變化及Notch信號通路相關(guān)信號Notch1、Jagged-2、P-Akt和Nf-kB表達水平的變化。

3、
　　結(jié)果：1.MTT比色法結(jié)果顯示：不同劑量CUS（0、0.0078、0.0156、0.0625、0.125、2.0umol/L）作用RPMI8226細胞不同時間（24h、48h、72h）后增殖抑制率從7.0％提高到86.4%，其24h、48h、72h的IC50分別為80umol/L，0.65umol/L，0.2umol/L。呈時間和劑量依賴性。各時段CUS干預(yù)組與陰性組比較有顯著性差異（P<0.01）。2.生長曲線結(jié)果表明：C

4、US藥物處理組的細胞生長狀態(tài)明顯不如對照組，隨著藥物濃度的增加，細胞數(shù)明顯減少，其生長緩慢的潛伏期延長，對數(shù)期曲線的斜率趨于平緩。不同劑量CUS干預(yù)組與陰性組比較有顯著性差異（P<0.05）。3.集落增殖抑制試驗表明：不同劑量CUS(0.0078、0.0156、0.0312、0.0625、0.125、0.25umol/L)作用RPMI8226細胞7天后集落形成率由50.5%減少到5%，集落抑制率由18.5%提高到91.9%。不同劑量CU

5、S干預(yù)組與陰性組比較有顯著性差異（P<0.05）。4.透射電鏡觀察到：與對照組相比，實驗組細胞體積變小、皺縮，細胞核明顯減小且不規(guī)則，核質(zhì)比減小，核呈現(xiàn)分葉、破碎及邊集等凋亡現(xiàn)象，核內(nèi)異染色質(zhì)增多，染色質(zhì)固縮、濃集，出現(xiàn)典型的凋亡改變，并有凋亡小體(Apoptosis body)形成。5.Annexin V/PI雙染流式細胞術(shù)檢測凋亡率呈量效關(guān)系逐漸增加，不同濃度CUS（0、0.125、0.5和2umol/L）各組的凋亡率分別為：7.4

6、4、12.49、17.48和26.41％。PI單染流式細胞儀結(jié)果顯示也同樣呈明顯的濃度依賴性，DNA倍體分析呈現(xiàn)典型的亞G1(sub-G1)凋亡峰，不同濃度CUS（0、0.0078、0.0312、0.125、0.25umol/L）作用72h后的凋亡率分別為0、4.2、10.8、30.6和42.2％，呈劑量依賴性。不同劑量CUS干預(yù)組與陰性組比較有顯著性差異（P<0.05）。6.Western blot結(jié)果顯示：CUS作用RPMI8226

7、細胞72h后，bcl-2表達水平明顯下調(diào)，而caspase-3和caspase-8、caspase-9則表達顯著上調(diào)，呈明顯的時間和濃度依賴性。同時有關(guān)Notch信號通路Notch1、Jagged-2、P-Akt和Nf-kB也以時間和濃度依賴的方式表達下調(diào)。
　　結(jié)論：1.CUS對體外培養(yǎng)的RPMI8226細胞具有明顯的增殖抑制作用，并呈時間-劑量依性。2.CUS能有效誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細胞凋亡，并在一定濃度范圍內(nèi)呈