Notch通路中Notch1分子和Akt信號(hào)在骨髓瘤鼠模型中腫瘤增長(zhǎng)作用的研究.pdf

1、背景：多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的造血系統(tǒng)惡性疾患，其發(fā)生發(fā)展與骨髓瘤細(xì)胞的異常增殖和微環(huán)境的血管生成密切相關(guān)，骨髓瘤細(xì)胞增殖比例低以及對(duì)多種藥物耐藥的形成，使得MM的臨床治療仍十分困難。Notch信號(hào)通路與MM的發(fā)生具有密切的聯(lián)系，骨髓瘤細(xì)胞和骨鏈瘤基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)大量Notch受體和配體，激活Notch信號(hào)通路對(duì)骨髓瘤的發(fā)生和耐藥起重要作用。Akt與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，有學(xué)者報(bào)道No

2、tch信號(hào)和PI3K/Akt通路可相互激活。γ-分泌酶抑制劑(gamma secretase inhibitor，GSI)能夠有效抑制Notch1的激活，近期多數(shù)研究報(bào)道蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)MM細(xì)胞株凋亡的同時(shí)伴有Notch1表達(dá)的降低，用GSI阻斷Notch1可降低Akt的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。因此，我們利用GSI下調(diào)Notch表達(dá)深入探討Notch1及Akt在MM小鼠模型中的作用及其機(jī)制。
　　 目的：研究GSI抑制Not

3、ch1及Akt的激活對(duì)腫瘤的增長(zhǎng)、細(xì)胞因子分泌等生物學(xué)行為的影響和腫瘤血管生成的改變，探討Notch1及Akt在MM小鼠模型中的作用及其機(jī)制。將為MM的靶向治療提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。
　　 方法：⑴體外培養(yǎng)MM細(xì)胞株RPMI8226，將人骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226細(xì)胞通過(guò)皮下注射接種于糖尿病抵抗/重癥聯(lián)合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠，建立異體移植動(dòng)物模型。⑵連續(xù)監(jiān)測(cè)骨髓瘤細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)情況，觀(guān)察腫瘤的大小變化。⑶

4、分別應(yīng)用GSI、生理鹽水瘤內(nèi)注射各一組小鼠(9只)，觀(guān)測(cè)實(shí)驗(yàn)組(GSI組)、對(duì)照組(生理鹽水組)腫瘤增長(zhǎng)的變化。⑷免疫組織化學(xué)方法：分離、摘除小鼠皮下瘤塊，用10％甲醛固定、石蠟包埋并進(jìn)行蘇木精-伊紅染色；免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)Notch1、Akt表達(dá)及定位。⑸Western blot檢測(cè)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況：分離、摘除小鼠皮下瘤塊，液氮研磨后，提取細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測(cè)Notch1、Akt蛋白的表達(dá)情況。
　　

5、 結(jié)果：①成功建立于糖尿病抵抗/重癥聯(lián)合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠異體移植動(dòng)物模型。②移植成瘤率：接種骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226細(xì)胞5-14天(平均7天)后，18只NOD/SCID小鼠左側(cè)或右側(cè)腹股溝區(qū)均見(jiàn)可測(cè)腫塊，成瘤后第3天平均體積為5.26mm3，第6天平均體積為66.76mm3，第9天平均體積為274.48mm3，第12天平均體積為510.26mm3，成瘤率100％。③實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般狀況：對(duì)照組(生理鹽水組)NOD/SC

6、ID小鼠隨著腫瘤體積的增大精神逐漸萎靡、活動(dòng)減少、皮膚光澤度差、飲食飲水量減少；而實(shí)驗(yàn)組(注射GSI藥物)小鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)皮膚光澤、飲水、飲食量?jī)?yōu)于對(duì)照組；檢測(cè)腫瘤體積變化結(jié)果表明GSI可抑制多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞荷瘤NOD/SCID鼠移植腫瘤在體內(nèi)的生長(zhǎng)。在骨髓瘤小鼠模型中，實(shí)驗(yàn)組移植瘤平均體積(683.5mm3)較對(duì)照組(1798.7mm3)明顯減小，p<0.01。④腫瘤免疫組化方法檢測(cè)Notch1、Akt定位及表達(dá)：N

7、otch1定位于細(xì)胞膜、細(xì)胞胞漿或胞核內(nèi)，Akt主要定位于細(xì)胞胞漿，其次定位于細(xì)胞膜或細(xì)胞核。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組Notch1陽(yáng)性率分別為11.1％和95.6％，Akt陽(yáng)性率分別為13.3％和93.3％，實(shí)驗(yàn)組Notch1及Akt較對(duì)照組表達(dá)明顯減少。⑤Western blot結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組Notch1基因及Akt基因蛋白質(zhì)的表達(dá)明顯低于對(duì)照組，提示GSI可抑制Notch1、Akt蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)論：⑴通過(guò)多發(fā)性骨髓瘤移植瘤動(dòng)