Notch1—RBP-Jκ信號(hào)通路在動(dòng)脈中膜鈣化中的作用.pdf

1、第一部分Notch1—RBP-Jκ信號(hào)通路與動(dòng)脈中膜鈣化的關(guān)系
　　目的:明確Notch1–RBP-Jκ信號(hào)通路和血管平滑肌細(xì)胞鈣化的相關(guān)性。
　　方法:建立鈣化模型,按鈣化干預(yù)時(shí)間分為鈣化0天、7天和14天三組。應(yīng)用vonkossa染色、鈣離子含量測定、堿性磷酸酶(ALP)活性并檢測Msx2表達(dá)以明確VSMCs成骨樣轉(zhuǎn)化;RT-PCR和westernblot檢測Notch1、RBP-JκmRNA和蛋白表達(dá)、免疫組化檢測N1

2、-ICD蛋白以明確Notch1—RBP-Jκ信號(hào)通路表達(dá)和激活。
　　結(jié)果:vonkossa染色顯示VSMCs鈣化模型中鈣沉積隨鈣化干預(yù)時(shí)間延長而增加:鈣化7天組可見少量散在鈣沉積,鈣化14天組有明顯黑色鈣沉積。隨鈣化干預(yù)時(shí)間增加鈣離子含量表達(dá)上升:鈣化14天組表達(dá)最高(P<0.05)。Notch1、RBP-JκmRNA和蛋白均隨鈣化程度增加表達(dá)上升,鈣化14天組表達(dá)最高(P<0.05),Msx2表達(dá)在鈣化14天組表達(dá)最高(P<0

3、.05)。免疫組化結(jié)果顯示N1-ICD蛋白表達(dá)也隨鈣化程度增加而增加。
　　結(jié)論:動(dòng)脈中膜鈣化過程中,Notch1–RBP-Jκ信號(hào)通路表達(dá)增加并被激活,其表達(dá)同VSMCs鈣化程度呈正相關(guān)。
　　第二部分Notch1–RBP-Jκ信號(hào)通路對(duì)動(dòng)脈中膜鈣化的影響
　　目的:探討抑制Notch1信號(hào)通路對(duì)VSMCs鈣化的影響。
　　方法:建立VSMCs鈣化模型和Notch1信號(hào)抑制模型(DAPT:Notch1信號(hào)抑制劑

4、)。按干預(yù)時(shí)間分為六組,分別為鈣化0天組、7天組和14天組,與DAPT0天組、7天組和14天組。檢測Notch1、RBP-JkmRNA和蛋白表達(dá)及N1-ICD蛋白表達(dá),明確Notch1—RBP-Jk信號(hào)通路激活情況。檢測VSMCs鈣鹽沉積程度(vonkossa染色、鈣離子含量測定)和檢測鈣調(diào)節(jié)相關(guān)標(biāo)志物(ALP活性、Msx2含量),明確VSMCs成骨樣轉(zhuǎn)化程度。
　　結(jié)果:加入DAPT后,DAPT組與干預(yù)相同時(shí)間的鈣化組相比,No

5、tch1、RBP-JκmRNA和蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05),免疫組化顯示N1-ICD下調(diào),Notch1信號(hào)通路受抑制。vonkossa染色可見,同干預(yù)相同時(shí)間鈣化組相比,DAPT14天組鈣鹽沉積程度明顯減輕,鈣離子含量和ALP活力下降(P<0.05),成骨樣轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)錄因子Msx2表達(dá)下降(P<0.05).
　　結(jié)論:抑制Notch1信號(hào)表達(dá)和激活,動(dòng)脈中膜鈣化受抑制。
　　第三部分骨保護(hù)素在動(dòng)脈中膜鈣化過程中對(duì)Notch

6、1—RBP-Jκ信號(hào)通路的作用
　　目的:骨保護(hù)素(OPG)在動(dòng)脈中膜鈣化過程中對(duì)Notch1—RBP-Jκ信號(hào)通路的作用。
　　方法:本實(shí)驗(yàn)中VSMCs被分為四組:鈣化組、OPG組1(0.1ng/ml)、OPG組2(1ng/ml)和OPG組3(10ng/ml)。干預(yù)14天后,應(yīng)用vonkossa染色、鈣離子含量測定、堿性磷酸酶(ALP)活性并檢測Msx2表達(dá)以明確VSMCs成骨樣轉(zhuǎn)化;QT-PCR和westernblot檢

7、測Notch1、RBP-JκmRNA和蛋白表達(dá)、免疫組化檢測N1-ICD以明確Notch1—RBP-Jκ信號(hào)通路表達(dá)和激活。
　　結(jié)果:同鈣化組相比,OPG干預(yù)組vonkossa染色黑色鈣鹽沉積明顯減輕,鈣離子含量、ALP活性和Msx2表達(dá),均隨OPG干預(yù)濃度的增加明顯下降(P<0.05)。Notch1、RBP-Jκ蛋白和mRNA水平表達(dá)也隨OPG濃度增加而減少(P<0.05)。
　　結(jié)論:OPG可抑制血管平滑肌細(xì)胞鈣化發(fā)生

8、,同時(shí)抑制Notch1—RBP-Jκ信號(hào)表達(dá)和激活,其效應(yīng)呈現(xiàn)濃度依賴性。
　　第四部分阿侖膦酸鈉在動(dòng)脈中膜鈣化過程中對(duì)Notch1信號(hào)的作用
　　目的:探討阿侖膦酸鈉(alendronate,ALN)在動(dòng)脈中膜鈣化過程中對(duì)Notch1—RBP-Jκ信號(hào)通路的作用。
　　方法:VSMCs按照不同干預(yù)被分為七組:對(duì)照組、鈣化組、DAPT組、ALN組1(10-8mmol/l)、ALN組2(10-6mmol/l)、ALN組3

9、(10-4mmol/l)和ALN組4(10-3mmol/l)。干預(yù)14天后應(yīng)用vonkossa染色、鈣離子含量測定、堿性磷酸酶(ALP)活性、Msx2表達(dá)以明確VSMCs成骨樣轉(zhuǎn)化;QT-PCR和westernblot檢測Notch1、RBP-JκmRNA和蛋白表達(dá)、免疫組化檢測N1-ICD以明確Notch1信號(hào)通路表達(dá)和激活。
　　結(jié)果:同鈣化組相比,vonkossa染色證實(shí)鈣鹽沉積隨ALN干預(yù)濃度增加明顯減輕,鈣離子含量、AL