Notch1信號(hào)通路在H9c2心肌細(xì)胞缺血后處理中對(duì)細(xì)胞凋亡作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　探討Notch1信號(hào)通路在H9c2心肌細(xì)胞缺血后處理心肌保護(hù)中對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，為防治心肌缺血再灌注損傷提供新靶點(diǎn)。
　　方法:
　　采用大鼠H9c2心肌細(xì)胞構(gòu)建缺氧復(fù)氧模型（H/R）和缺氧后處理模型(H-post)，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Myc-His質(zhì)粒和pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miRNA干擾質(zhì)粒，上調(diào)和下調(diào)Notch1信號(hào)，將H9c2心肌細(xì)胞隨機(jī)分為6組:Control組，H/

2、R組，N1ICD+H/R組，H-post組，miRNA+H-post組，Mock組。采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率，real-time PCR和Western-blotting檢測(cè)凋亡基因蛋白Bcl-2和Bax表達(dá)變化情況，caspase活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)caspase-9活性和caspase-3活性。探討Notch1信號(hào)通路在心肌缺氧后處理心肌保護(hù)中對(duì)大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響。
　　結(jié)果:
　　1.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

3、率測(cè)定:與Control組相比，H/R組細(xì)胞凋亡率顯著升高（6.21±0.98％和0.8±0.12％），兩者有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);當(dāng)N1ICD質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上調(diào)Notch1信號(hào)表達(dá)后，N1ICD+H/R組與H/R組相比細(xì)胞凋亡率明顯下降（3.10±0.17％和6.21±0.98％），兩者有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);H-post組細(xì)胞凋亡率與H/R組相比下降明顯（1.98±0.18％和6.21±0.98％），有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(

4、P＜0.05);miRNA干擾下調(diào)Notch1信號(hào)表達(dá)后，miRNA+H-post組與H-post組相比，細(xì)胞凋亡率明顯增高（6.30±0.26％和1.98±0.18％），有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。
　　2.凋亡基因蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)情況:real-time PCR檢測(cè)凋亡基因Bcl-2mRNA和Bax mRNA表達(dá)水平:H/R組與Control組相比，Bax mRNA表達(dá)顯著增加(P＜0.05)，Bcl-2 m

5、RNA表達(dá)顯著降低(P＜0.05);H-post組與H/R組相比Bax mRNA表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05)，Bcl-2 mRNA顯著增加(P＜0.05);miRNA+ H-post組與H-post組相比，Bax mRNA明顯高，而Bcl-2mRNA明顯降低(P＜0.01); N1ICD+H/R組與H/R組相比Bax mRNA表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05)，Bcl-2 mRNA顯著增加(P＜0.05)。通過Western-blot

6、ting檢測(cè)其蛋白表達(dá)情況，蛋白表達(dá)與相應(yīng)mRNA表達(dá)相一致。
　　3.Caspase活性檢測(cè)結(jié)果:與Control組相比，H/R組caspase-9和caspase-3活性明顯增高(P＜0.05)，通過N1 ICD質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，上調(diào)Notch1信號(hào)表達(dá)，N1ICD+H/R組與H/R組相比，N1ICD+H/R組caspase-9和caspase-3活性顯著降低(P＜0.05)，H-post組與H/R組相比，H-post組caspase