microRNA-24調(diào)控H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景與目的：
　　大量研究表明，心肌缺血、缺血再灌注損傷、心臟重塑等心血管疾病的病理進(jìn)程中可產(chǎn)生較多氧自由基，大量的氧自由基可引起心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，造成細(xì)胞器受損、DNA斷裂、細(xì)胞膜破損，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死和凋亡，心肌細(xì)胞大量的壞死和凋亡又進(jìn)一步加重疾病的嚴(yán)重程度，形成惡性循環(huán)。壞死常常發(fā)生在心肌缺血晚期，而凋亡則貫穿眾多心血管疾病的整個(gè)病程，因此減輕心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，減少心肌細(xì)胞凋亡對(duì)臨床心血管疾病的治療具有重要的意義

2、。
　　MicroRNAs(miRNAs)于1993年在線蟲體內(nèi)首次被發(fā)現(xiàn)，是一類長(zhǎng)度約為18-25nt的單鏈非編碼小分子RNA，其作為多靶點(diǎn)調(diào)控的上游調(diào)控因子，越來越受到人們的關(guān)注。目前已有多種miRNAs在動(dòng)植物體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，其通過抑制靶基因mRNA的翻譯過程，參與細(xì)胞增殖、分化與凋亡等的調(diào)節(jié);與個(gè)體發(fā)育、機(jī)體代謝以及多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。已有研究證明miRNAs能夠調(diào)控多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展，如miR-133a，miR

3、-26和miR-221調(diào)控心肌缺血引起的心臟重構(gòu)、心衰、心肌纖維化等，但相關(guān)miRNA調(diào)控氧化應(yīng)激損傷引起的心肌細(xì)胞凋亡的研究罕見報(bào)道。
　　本研究采用不同濃度H2O2處理H9c2心肌細(xì)胞，選擇最佳H2O2濃度建立心肌細(xì)胞凋亡模型，慢病毒轉(zhuǎn)染miR-24，探討miR-24對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響及分子機(jī)制。
　　針對(duì)以上實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，本課題擬進(jìn)行如下研究:(1)體外培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞，采用不同濃度H2O2處理

4、H9c2心肌細(xì)胞，MTT法檢測(cè)不同濃度H2O2對(duì)H9c2心肌細(xì)胞增殖活性的影響，計(jì)算抑制率，篩選最佳H2O2濃度，建立心肌細(xì)胞凋亡模型(2)采用慢病毒轉(zhuǎn)染方法上調(diào)H9c2心肌細(xì)胞中miR-24水平，探討miR-24對(duì)H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響。(3)檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-24后其靶基因E2F1的表達(dá)情況，探討miR-24對(duì)H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡調(diào)控的分子機(jī)制。為揭示miR-24在H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡中的調(diào)控作用提供實(shí)驗(yàn)

5、依據(jù)。
　　方法：
　　(1)不同濃度H2O2(25、50、100、200、400μmol/L)作用于H9c2心肌細(xì)胞，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，計(jì)算抑制率，選擇細(xì)胞增殖抑制率50％左右時(shí)的H2O2濃度建立心肌細(xì)胞凋亡模型。構(gòu)建miR-24慢病毒及陰性對(duì)照載體，轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡下估算轉(zhuǎn)染率，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-24及E2F1的表達(dá)水平，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。
　　(2)將H9c2心肌細(xì)胞分為正常對(duì)

6、照組(NC組）、H2O2組、轉(zhuǎn)染慢病毒陰性對(duì)照+H2O2組（LV-GFP+H2O2組）、轉(zhuǎn)染miR-24+H2O2組(LV-miR-24-GFP+H2O2組)。
　　(3)FITC-AnnexinV/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組H9c2心肌細(xì)胞凋亡情況。
　　(4)采用2-ΔΔCT實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)定量測(cè)定各組H9c2心肌細(xì)胞miR-24及E2F1mR

7、NA的表達(dá)水平。
　　采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，正態(tài)分布的兩組數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，正態(tài)分布的兩組以上數(shù)據(jù)采用方差分析，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)，顯著水準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果：
　　1.不同濃度H2O2對(duì)H9c2心肌細(xì)胞增殖活性的影響:
　　MTT法檢測(cè)不同濃度H2O2對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響，細(xì)胞增殖抑制率(IR％)=1-處理組平均吸光度值/對(duì)照

8、組平均吸光度值。25、50、100、200、400μmol/LH2O2分別處理H9c2心肌細(xì)胞6h，結(jié)果顯示，隨著過氧化氫濃度的增加，對(duì)H9c2心肌細(xì)胞的抑制率越大，細(xì)胞凋亡的越多;過氧化氫的濃度為200μmol/L時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率約為55％，因此采用200μmol/L的過氧化氫制作H9c2心肌細(xì)胞凋亡模型。
　　2.慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染:
　　LV-miR-24-GFP及LV-GFP慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建由上海吉?jiǎng)P基

9、因化學(xué)公司完成，獲得的慢病毒以1×109TU/mI共40μL即4×107TU的病毒數(shù)進(jìn)行H9c2心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染72h后熒光顯微鏡下觀察GFP綠色熒光，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率均達(dá)80％以上，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染LV-miR-24-GFP、LV-GFP慢病毒的細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞miR-24的表達(dá)水平分別為（12.88±0.75vs3.16±1.01vs3.23±0.89），E2F1mRNA的表達(dá)水平分別為（4.11±0.77vs6.29±0.

10、98vs6.70±1.04），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），轉(zhuǎn)染成功。
　　3.各組H9c2心肌細(xì)胞凋亡水平比較:
　　(1)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，H2O2組與NC組比較細(xì)胞凋亡率顯著升高(P＜0.05)。
　　(2)LV-miR-24-GFP+H2O2組與LV-GFP+H2O2及H2O2組比較細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05）。
　　4.各組H9c2心肌細(xì)胞miR-24及E2F1mRNA表達(dá)水平比較:

11、>　　(1)H2O2組與NC組miR-24的表達(dá)量分別為(0.70±0.24vs3.23±0.89)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);E2F1mRNA的表達(dá)量分別為(11.12±1.81vs6.70±1.04)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(2)LV-miR-24-GFP+H2O2組、LV-GFP+H2O組及H2O2組miR-24的表達(dá)量分別為（2.25±1.24vs0.72±0.12vs0.70±0.24），差

12、異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);E2F1的表達(dá)量分別為（8.30±1.04vs11.24±1.78vs11.12±1.81），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　(1)H2O2可誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞凋亡。
　　(2)經(jīng)H2O2處理的H9c2心肌細(xì)胞中，miR-24表達(dá)明顯減低，其靶基因E2F1表達(dá)升高。
　　(3)慢病毒轉(zhuǎn)染miR-24可抑制H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡，此作用機(jī)制可能是