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文檔簡介
1、SO2是大氣中主要污染物之一,SO2吸入后所引起的心血管系統(tǒng)疾病也正受到廣泛的關注。有資料顯示SO2吸入增加了心血管疾病的發(fā)生率和死亡率。本課題組的前期研究發(fā)現,SO2及其衍生物NaHSO3可誘導大鼠心肌細胞線粒體結構及功能的紊亂,表現為線粒體膜電位、細胞色素C氧化酶活性及ATP含量降低。與此同時,線粒體DNA(mtDNA)含量減少,線粒體DNA編碼的氧化磷酸化復合體亞基mRNA表達降低,調控線粒體DNA的過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔
2、激活因子1α(PGC-1α),核呼吸因子(NRF1)和線粒體轉錄因子(TFAM)的表達也降低。然而,SO2及其衍生物是否通過PGC-1α-NRF1-TFAM-mtDNA-mtRNA-ATP這一信號途徑來誘導線粒體功能的紊亂尚不確定。
為此,首先構建了NRF1-pcDNA3.1及TFAM-pcDNA3.1重組質粒,并將其在H9C2細胞中瞬時高表達后,再用100μM的NaHSO3處理H9C2心肌細胞24h,之后分別采用Wester
3、n blot檢測NRF1及TFAM的表達情況,采用熒光定量RT-PCR技術檢測線粒體氧化磷酸化復合體Ⅳ亞基中由mtDNA編碼的CO3的mRNA表達情況,采用化學發(fā)光法檢測ATP含量。來驗證NRF1及TFAM在PGC-1α-NRF1-TFAM-mtDNA-mtRNA-ATP這一信號通路中的作用。結果發(fā)現,高表達NRF1后,NRF1和TFAM的蛋白表達水平均升高,高表達TFAM后TFAM的蛋白表達水平也升高。與此同時,由mtDNA編碼的復合
4、體Ⅳ亞基CO3的mRNA水平也比NaHSO3處理組升高。兩種蛋白的高表達均可以減輕NaHSO3導致的H9C2細胞線粒體功能障礙,表現為ATP含量升高。
此外,采用100μM的NaHSO3對大鼠H9C2心肌細胞進行不同時間(0,3,6,12,24h)的體外染毒。采用流式細胞儀檢測細胞中ROS產生情況,發(fā)現NaHSO3可誘導ROS時間依賴性升高。用5mMN-乙酰-L-半胱氨酸(NALC)處理H9C2心肌細胞后,再用100μM的Na
5、HSO3處理24h,采用流式細胞儀檢測細胞的ROS含量,采用熒光定量RT-PCR技術檢測調控線粒體氧化磷酸化功能的核轉錄因子TFAM的mRNA表達情況,采用化學發(fā)光法檢測ATP含量。發(fā)現NALC可以阻止NaHSO3誘導的H9C2細胞ATP含量降低、ROS含量升高以及TFAM轉錄水平降低這些現象的發(fā)生。
最后,采用100μM的NaHSO3對大鼠H9C2心肌細胞進行不同時間(0,3,6,12,24h)的體外染毒后,采用流式細胞儀檢
6、測細胞凋亡情況,采用免疫熒光技術檢測細胞內凋亡相關蛋白(cytc,bax和p53)的表達情況,采用分光光度法測caspase-3活性采用Western blot技術檢測凋亡相關蛋白(cleaved caspase-3,cleaved caspase-9,p53,p53-ser15,bcl-2和bax)的表達情況。結果表明,不同時間NaHSO3處理H9C2細胞后,心肌細胞產生凋亡現象caspase-3活性升高;cytc、cleaved c
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