胰島素對脂多糖誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞損傷的保護作用及其機制.pdf

1、目的：膿毒癥是兒童重癥監(jiān)護病房(pediatric intensive care unit，PICU)最常見的危重病之一，其發(fā)病率和死亡率高。本實驗以H9c2心肌細(xì)胞為研究對象，通過LPS誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷模擬膿毒癥心肌損傷模型，觀察胰島素對膿毒癥心肌損傷的保護作用以及UCP2可能的作用，探討胰島素對其表達的影響，從而證實胰島素的多重作用，并為胰島素在臨床膿毒癥患者中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　方法：1.建立H9C2心肌細(xì)胞

2、損傷模型及分組
　　把H9C2心肌細(xì)胞正常培養(yǎng)24h后隨機分為對照組（CON組）、LPS刺激組（LPS組）、LPS+70IU/L胰島素組（IN70 IU/L組）、LPS+350 IU/L胰島素組（IN350 IU/L組）和LPS+700IU/L胰島素組（IN700 IU/L組）5組，胰島素處理組于LPS刺激前15min加入相應(yīng)劑量胰島素，對照組加入與LPS等量的生理鹽水。然后LPS組和胰島素處理組都接受脂多糖處理24h。上述LPS

3、組和胰島素處理組中LPS的終濃度為1ug/ml。
　　2.檢測標(biāo)本的收集和檢測
　　2.1 檢測標(biāo)本的收集
　　處理結(jié)束后收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液標(biāo)本和細(xì)胞標(biāo)本，細(xì)胞培養(yǎng)液標(biāo)本適當(dāng)分裝后放在-80℃保存?zhèn)溆?，?xì)胞標(biāo)本收集后立刻進行蛋白提取或RNA提取。
　　2.2 乳酸脫氫酶(LDH)及心肌細(xì)胞活力檢測
　　按照LDH和細(xì)胞活力檢測試劑盒說明書進行操作。
　　2.3 丙二醛(MDA)水平及總超氧化物歧化酶(

4、SOD)活力檢測
　　按照MDA和SOD檢測試劑盒說明書進行。通過BCA法檢測細(xì)胞蛋白濃度，按照說明書要求加入反應(yīng)液后反應(yīng)，酶標(biāo)儀上測OD值，根據(jù)說明書公式計算結(jié)果。
　　2.4 活性氧（ROS）水平的檢測
　　按照說明書要求通過比色法檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平
　　2.5 腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)水平檢測
　　按照說明書要求，運用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELIS

5、A法）檢測培養(yǎng)液TNF-α和IL-1β水平
　　2.6 UCP2mRNA表達檢測
　　通過實時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測UCP2mRNA水平。按照Takara公司試劑盒進行細(xì)胞RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)。以β-actin作為內(nèi)參基因，計算UCP2mRNA相對表達水平。
　　2.7 UCP2蛋白表達檢測
　　通過蛋白提取試劑盒提取心肌細(xì)胞蛋白，用BCA法測定細(xì)胞蛋白濃度。運用蛋白免疫印跡法檢測UC

6、P2蛋白表達。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，比較各條帶的灰度值，分析UCP2蛋白表達水平。
　　3.統(tǒng)計學(xué)分析
　　所有數(shù)據(jù)使用IBMSPSS20.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示統(tǒng)計結(jié)果。多樣本間均數(shù)的比較采用單因素方差分析(one-wayANOVA)，方差齊時兩組均數(shù)比較采用LSD法檢驗，方差不齊時采用Dunnett T3法。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：1.各組H9C

7、2心肌細(xì)胞培養(yǎng)液LDH酶水平比較
　　與對照組比較，LPS組LDH水平顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。而與LPS組比較，IN350 IU/L和IN700 IU/L兩組的LDH水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與IN70IU/L及IN700IU/L組比較，350 IU/L組的LDH水平更低。
　　2.各組H9C2心肌細(xì)胞細(xì)胞活力比較
　　與對照組比較，LPS組細(xì)胞活力下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜

8、0.05)。而與LPS組比較，IN350 IU/L和IN700 IU/L兩組的細(xì)胞活力升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與IN70IU/L及IN700IU/L組比較，350 IU/L組的細(xì)胞活力更高。
　　3.各組H9C2心肌細(xì)胞MDA含量比較
　　與對照組比較，LPS組心肌細(xì)胞中MDA含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與LPS組比較，350IU/L和700IU/L兩種劑量的胰島素處理能夠明顯降低心肌細(xì)胞

9、中MDA含量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與IN70 IU/L組及IN700 IU/L組比較，IN350IU/L組的MDA含量更低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　4.各組心肌細(xì)胞SOD活力比較
　　與對照組比較，LPS組心肌細(xì)胞中SOD活力明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與LPS組比較，350IU/L和700IU/L兩種劑量的胰島素處理能夠明顯升高細(xì)胞中SOD活力，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)

10、。與IN70 IU/L組及IN700 IU/L組比較，IN350IU/L組的SOD活力更高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　5.各組心肌細(xì)胞ROS水平比較
　　與對照組比較，LPS組心肌細(xì)胞中ROS水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與LPS組比較，350IU/L和700IU/L兩種劑量的胰島素處理能夠明顯降低心肌細(xì)胞中ROS水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與IN70 IU/L組及IN700 IU

11、/L組比較，IN350IU/L組的ROS水平更低。
　　6.各組H9C2心肌細(xì)胞培養(yǎng)液TNF-α水平比較
　　與對照組比較，LPS組TNF-α水平顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。而與LPS組比較，IN350 IU/L和IN700 IU/L兩組的TNF-α水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與700 IU/L組比較，350 IU/L組的TNF-α水平更低。
　　7.各組H9C2心肌細(xì)胞培養(yǎng)液IL-

12、1β水平比較
　　與對照組比較，LPS組IL-1β水平增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與LPS組比較，胰島素處理能稍降低IL-1β水平，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　8.各組H9C2心肌細(xì)胞中UCP2mRNA表達變化
　　與對照組比較，LPS組心肌細(xì)胞內(nèi)UCP2mRNA表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與LPS組比較，IN350 IU/L和IN700 IU/L兩組細(xì)胞的UCP2mR

13、NA表達均有升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。以IN350IU/L胰島素作用較好(P＜0.05)。
　　9.各組H9C2心肌細(xì)胞中UCP2蛋白表達變化
　　與對照組比較，LPS組心肌細(xì)胞內(nèi)UCP2蛋白表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與LPS組比較，IN350 IU/L和IN700 IU/L兩組細(xì)胞的UCP2蛋白表達均有升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。以IN350IU/L胰島素作用較好(P＜0