野薔薇苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:本課題組前期研究表明，蕨麻的正丁醇提取部位能夠明顯改善缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞活力，抑制大鼠心肌細(xì)胞凋亡，其中提取分離出來(lái)的活性單體“野薔薇苷”，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的缺氧損傷具有顯著的保護(hù)作用，且其機(jī)制可能與抗氧化作用有關(guān)。但目前“野薔薇苷”在心肌細(xì)胞氧化性損傷中的作用及其調(diào)控機(jī)制還不清楚。因此，本研究在課題組前期工作的基礎(chǔ)上，選取H9c2細(xì)胞作為研究對(duì)象，通過(guò)建立H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化損傷的模型，觀察“野薔薇苷”對(duì)心肌細(xì)胞氧化損傷的

2、保護(hù)作用，并探討其分子機(jī)制。
　　方法:
　　1、氧化損傷模型的建立:采用MTT法檢測(cè)心肌細(xì)胞的活力變化，確定H2O2最佳誘導(dǎo)損傷的時(shí)間和濃度，建立細(xì)胞損傷模型。
　　2、實(shí)驗(yàn)分組:取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的H9c2心肌細(xì)胞隨機(jī)分為:正常對(duì)照組、H2O2(200μmol/l)損傷模型組、野薔薇苷1×10-11mol/l、1×10-12mol/l、1×10-13 mol/l干預(yù)組（同時(shí)加入野薔薇苷和H2O2），陽(yáng)性藥維拉帕米組（1

3、×10-1mol/l）。
　　3、實(shí)驗(yàn)檢測(cè)指標(biāo):
　　3.1采用生化指標(biāo)檢測(cè)手段，測(cè)定培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)與肌酸、激酶(CK)活性變化;檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性變化、丙二醛(MDA)釋放量的變化，過(guò)氧化氫酶(CAT)活力、谷胱甘肽氧化酶(GSH-Px);觀察“野薔薇苷”對(duì)H2O2所致心肌細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。
　　3.2采用Hochest/PI染色、DAPI染色觀察“野薔薇苷”對(duì)心肌細(xì)胞形態(tài)及結(jié)

4、構(gòu)的影響。
　　3.3采用AnnexinⅤ/PI兩種熒光標(biāo)記，選用流式細(xì)胞儀檢測(cè)“野薔薇苷”對(duì)心肌細(xì)胞凋亡率的影響。
　　3.4采用流式細(xì)胞技術(shù)，測(cè)定“野薔薇苷”對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響。
　　3.5采用激光共聚焦顯微鏡，觀察“野薔薇苷”對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響。
　　3.6采用免疫印跡(Western Blot)技術(shù)，檢測(cè)cryab、Pcryab、akt、Pakt、bcl-2、bax、Cyt-c、ca

5、spase9、caspase3蛋白的表達(dá)水平;并通過(guò)加入PI3K/AKT通路阻滯劑LY294002后，檢測(cè)心肌細(xì)胞的活力變化，觀察Pakt、caspase3蛋白的表達(dá)變化，探討“野薔薇苷”抗心肌細(xì)胞氧化性損傷的分子機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1、氧化損傷模型的建立
　　隨著過(guò)氧化氫處理時(shí)間的延長(zhǎng)和過(guò)氧化氫濃度的升高，心肌細(xì)胞活力逐漸降低，其中采取200μmol/l過(guò)氧化氫處理3h后，細(xì)胞損傷明顯，且細(xì)胞存活率穩(wěn)定、適中，適

6、于建立心肌細(xì)胞的氧化性損傷模型。
　　2、藥物濃度的確定
　　通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)和LDH檢測(cè)的結(jié)果，確定野薔薇苷高、中、低濃度分別為1×10-11mol/l、1×10-12mol/l、1×10-13mol/l，陽(yáng)性對(duì)照藥維拉帕米濃度選擇為1×10-11mol/l。
　　3、野薔薇苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用
　　3.1 MTT結(jié)果:與正常對(duì)照組對(duì)比，H2O2損傷模型組心肌細(xì)胞活力明顯降低(P＜0.01)

7、，給予各濃度野薔薇苷和維拉帕米處理后，心肌細(xì)胞活力較模型組明顯提高(P＜0.01)。
　　3.2生化指標(biāo)結(jié)果:野薔薇苷各濃度組和維拉帕米處理后能夠明顯低H2O2引起的LDH(P＜0.01)和CK(P＜0.01)的釋放;能夠明顯減少M(fèi)DA(P＜0.01)的產(chǎn)生，提高細(xì)胞內(nèi)SOD(P＜0.01)的水平;此外，野薔薇苷各濃度組及維拉帕米組均能夠明顯抑制H2O2引起的心肌細(xì)胞內(nèi)CAT(P＜0.01)和GSH-Px酶的水平降低（P＜0.01

8、）。
　　3.3 Hoechst-PI染色:與正常對(duì)照組相比，損傷模型組細(xì)胞核凝集，細(xì)胞膜破裂，大量細(xì)胞處于晚期凋亡呈紅色熒光，而野薔薇苷各濃度組能夠明顯改變氧化損傷引起的染色質(zhì)凝集，減少紅染的細(xì)胞數(shù)目，改善細(xì)胞形態(tài)。
　　3.4 DAPI染色:野薔薇苷處理組與損傷模型組相比，可明顯的改善細(xì)胞氧化損傷引起的心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。
　　3.5流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果:給予H2O2處理后，心肌細(xì)胞ROS水平明顯提高(P＜0.01)，心

9、肌細(xì)胞凋亡率明顯增高(P＜0.01)，野薔薇苷各濃度組與維拉帕米均能夠明顯降低細(xì)胞內(nèi)ROS的水平(P＜0.01)，減少H2O2引起的細(xì)胞的凋亡率(P＜0.01)。
　　3.6激光共聚焦結(jié)果:與正常對(duì)照組相比，模型組熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，野薔薇苷各濃度組及維拉帕米組與模型組相比，熒光強(qiáng)度顯著降低。
　　4、野薔薇苷抗H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化損傷的機(jī)制研究
　　4.1Western blot結(jié)果:與正常對(duì)照組相比，H2O2損傷

10、模型組心肌細(xì)胞bcl-2表達(dá)水平明顯降低(P＜0.01)，Pcryab、Pakt、bax、Cyt-c、caspase3、caspase9表達(dá)水平顯著升高(P＜0.01)，野薔薇苷能夠上調(diào)氧化損傷心肌細(xì)胞中Pcryab、Pakt、bcl-2的表達(dá)水平(P＜0.01)，下調(diào)bax、Cyt-c、caspase9、csapsae3(P＜0.01)的表達(dá)水平。
　　4.2給予PI3K通路阻滯劑后細(xì)胞活力變化:野薔薇苷處理組給予PI3K/AK

11、T通路阻斷劑LY294002后，與氧化損傷模型組相比，心肌細(xì)胞活力明顯降低(P＜0.05)，與野薔薇苷處理組相比，細(xì)胞活力水平顯著減弱(P＜0.01)。
　　4.3給予PI3K通路阻滯劑后westemblot結(jié)果:野薔薇苷處理組加入LY294002后Pakt的表達(dá)水平較損傷模型組和野薔薇苷處理組均明顯降低(P＜0.01)，caspase3的表達(dá)水平較氧化損傷模型組減少(P＜0.05)，較野薔薇苷處理組明顯增加(P＜0.01)。