GLP-1對(duì)AGEs誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分：GLP-1對(duì)AGEs誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制研究
　　第一節(jié)：AGEs誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞損傷模型構(gòu)建
　　目的：
　　體外培養(yǎng)H9C2心肌細(xì)胞，運(yùn)用晚期糖基化終末產(chǎn)物（Advanced Glycation End Products, AGEs）誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞損傷，構(gòu)建AGEs心肌細(xì)胞損傷模型，為研究胰高血糖素樣肽-1（Glucogon like pep tide-1,GLP-1）對(duì)AGEs

2、誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞損傷的影響及機(jī)制提供平臺(tái)。
　　方法：
　　待H9C2心肌細(xì)胞融合85％左右，分別加入1mg·L-1 BSA（Control組），不同濃度AGEs-BSA（50、100、200mg·L-1），經(jīng)處理24h后；在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，并分別運(yùn)用LDH Cytotoxicity Assay Kit、Cell Counting Kit-8（CCK8）比色法及Hoechst33258核染色法，分別檢

3、測(cè)細(xì)胞乳酸脫氫酶（LDH）含量、細(xì)胞生存率及細(xì)胞凋亡率，觀察不同濃度的AGEs-BSA對(duì)H9C2心肌細(xì)胞的影響。
　　結(jié)果：
　　1）與Control組相比，AGEs-BSA呈濃度依賴(lài)性地導(dǎo)致H9C2心肌細(xì)胞損傷。主要表現(xiàn)為：隨著 AGEs-BSA濃度升高，細(xì)胞生存率、細(xì)胞凋亡率逐步降低，細(xì)胞中LDH含量呈現(xiàn)遞增，心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)顯現(xiàn)逐漸加重的損傷趨勢(shì)。
　　2）100mg·L-1AGEs-BSA與200 mg·L-1A

4、GEs-BSA組間細(xì)胞凋亡率無(wú)顯著差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1）AGEs-BSA呈濃度依賴(lài)性的誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞損傷。
　　2）100mg·L-1AGEs-BSA可作為AGEs誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的實(shí)驗(yàn)劑量濃度。
　　第二節(jié)：GLP-1對(duì)AGEs誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及機(jī)制研究
　　目的：
　　探討胰高血糖素樣肽素-1（Glucogon like pep tide-1, GLP-1

5、）對(duì)AGEs誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。
　　方法：
　　體外培養(yǎng)H9C2細(xì)胞，隨機(jī)分組為：Control組：1mg·L-1 BSA、AGEs組、AGEs+5nmol·L-1 GLP-1組、AGEs+10nmol·L-1GLP-1組、AGEs+20nmol·L-1GLP-1組，其中，AGEs為100mg·L-1AGEs-BSA。經(jīng)處理、培養(yǎng)24h后，通過(guò)熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，LDH Cytotoxic

6、ity Assay Kit檢測(cè)乳酸脫氫酶（LDH）活性，CCK-8比色法檢測(cè)細(xì)胞存活率，Hoechst33258試劑盒及Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率，RT-PCR法測(cè)定Bax、Bcl-2基因mRNA表達(dá)， Western Blot蛋白印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1）與 Control組相比，AGEs組可顯著降低 H9C2細(xì)胞生存率（P＜0.01），增加細(xì)胞中

7、LDH含量及細(xì)胞凋亡率（P＜0.05）。
　　2）與 AGEs組相比，經(jīng)10nmol·L-1、20nmol·L-1GLP-1干預(yù)后，細(xì)胞生成率均顯著提高（P＜0.05），細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶（LDH）含量及細(xì)胞凋亡率均明顯減少（P＜0.05）。
　　3）與Control組相比，100mg·L-1AGEs可致促凋亡蛋白Bax的mRNA及蛋白表達(dá)明顯增加、抑凋亡蛋白Bcl-2的mRNA及蛋白表達(dá)顯著減少（P＜0.05）；而經(jīng)10nm

8、ol·L-1 GL-P-1干預(yù)后，上述兩項(xiàng)指標(biāo)均出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)變化。
　　結(jié)論：
　　1）GLP-1對(duì)AGEs誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。
　　2）GLP-1可顯著抑制 AGEs誘導(dǎo)的 H9C2心肌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2有關(guān)。
　　第二部分：GLP-1對(duì)AGEs誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞自噬的影響及機(jī)制研究
　　第一節(jié)：AGEs對(duì)H9C2心肌細(xì)胞自噬的影響
　　目的：
　　探討

9、不同濃度AGEs對(duì)H9C2心肌細(xì)胞自噬（Autophagy）的影響。
　　方法：
　　在H9C2心肌細(xì)胞融合85%左右，隨機(jī)分組，Control：1mg·L-1 BSA，不同濃度AGEs-BSA（50、100、200mg·L-1）；經(jīng)培養(yǎng)24h后，運(yùn)用Western Blotting分別檢測(cè)不同濃度的AGEs對(duì)心肌細(xì)胞LC3B、Beclin1蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　1）LC3B、Beclin1蛋白隨著A

10、GEs濃度升高而呈增強(qiáng)表達(dá)趨勢(shì)。
　　2）與Control組相比，100mg·L-1、200mg·L-1 AGEs組的LC3B、Beclin1蛋白表達(dá)均分別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　3）在100mg·L-1AGEs組與200mg·L-1 AGEs組間，LC3B、Beclin1蛋白表達(dá)差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1）AGEs呈濃度依賴(lài)性地激活H9C2心肌細(xì)胞自噬。
　　2

11、）100mg·L-1 AGEs可作為自噬激活濃度。
　　第二節(jié)：GLP-1抑制AGEs誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞自噬及機(jī)制研究
　　目的：
　　觀察GLP-1對(duì)AGEs誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞自噬的影響，初步探討GLP-1心肌細(xì)胞保護(hù)作用與自噬活性關(guān)系。
　　方法：
　　體外培養(yǎng)H9C2細(xì)胞，隨機(jī)分組：1）Control組：加入1mg·L-1BSA；2）AGEs組：加入100mg·L-1AGEs；3）AGEs+GL

12、P-1組：同時(shí)加入100mg·L-1AGEs和10nmol·L-1 GLP-1；4）AGEs+GLP-1+Rapamycin組：同時(shí)加入100mg·L-1AGEs、10nmol·L-1 GLP-1及5μmol·L-1 Rapamycin（自噬誘導(dǎo)劑）。各組在經(jīng)上述處理24h后，分別用 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率，DCFH-DA熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞自噬溶酶體形成，RT-PCR檢測(cè)LC3、Beclin1

13、基因的mRNA水平， Western blot法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白（LC3B, Beclin-1）表達(dá)， Ad-mCherry-GFP-LC3B方法檢測(cè)細(xì)胞自噬流。
　　結(jié)果：
　　1）與Control組相比，AGEs組細(xì)胞生存率明顯減少（P＜0.01），細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著增高（P＜0.01），細(xì)胞自噬溶酶體水平、LC3B、Beclin1基因mRNA及蛋白表達(dá)均明顯增加（P＜0.05）；
　　2）與AGEs組相比，AG

14、Es+GLP-1組細(xì)胞生存率顯著增高（P＜0.05），細(xì)胞內(nèi)ROS水平，細(xì)胞自噬溶酶體水平，LC3B、Beclin1基因mRNA表達(dá)及蛋白表達(dá)均明顯下降（P＜0.05）；
　　3）與 AGEs組相比，AGEs+GLP-1+rapamycin組中細(xì)胞內(nèi) ROS水平降低（P＜0.05），而細(xì)胞生存率，細(xì)胞自噬溶酶體水平，LC3B、Beclin1基因mRNA表達(dá)及蛋白表達(dá)未見(jiàn)顯著差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1）A