羥基紅花黃素A對(duì)缺氧-復(fù)氧誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制研究.pdf

1、背景：隨著心臟移植、冠狀動(dòng)脈搭橋以及經(jīng)皮冠脈介入等治療手段廣泛地應(yīng)用于臨床，心肌缺血再灌注損傷已成為臨床上常見(jiàn)的一種病理生理現(xiàn)象。細(xì)胞凋亡在心肌缺血后即觸發(fā)并因再灌注而加重，減少缺血和再灌注過(guò)程中心肌細(xì)胞凋亡可以挽救更多的心肌，提高心肌缺血后再灌注治療的效果。血紅素氧合酶1(HO-1)，是血紅素氧合酶的誘導(dǎo)型，研究表明HO-1被誘導(dǎo)適應(yīng)性表達(dá)能發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用。多種因素可通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路ERK1/2或PI3K/Akt激活并促使紅細(xì)胞

2、系核因子-2相關(guān)因子-2(Nrf2)向核內(nèi)轉(zhuǎn)位、并與細(xì)胞核內(nèi)抗氧化反應(yīng)元件(ARE)上相應(yīng)位點(diǎn)相互作用，上調(diào)HO-1的表達(dá)與酶活力，減輕各種應(yīng)激狀態(tài)下組織細(xì)胞的損傷。羥基紅花黃素A(HSYA)是藥用植物紅花的最主要的有效成分。研究發(fā)現(xiàn)，HSYA可以減輕組織細(xì)胞的缺血再灌注損傷，可以抑制低氧誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。目前尚未見(jiàn)到有關(guān)HSYA對(duì)缺血再灌注過(guò)程中心肌細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制的研究報(bào)道。本研究探討了HSYA對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9c2心肌

3、細(xì)胞凋亡的影響及其分子機(jī)制，分兩部分進(jìn)行。
　　 第一部分：羥基紅花黃素A上調(diào)血紅素氧合酶-1的表達(dá)抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡
　　 目的：利用體外細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(A/R)模擬體內(nèi)組織細(xì)胞缺血再灌注誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞凋亡，給予HSYA干預(yù)，探討其對(duì)A/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響和其分子機(jī)制。
　　 方法：H9c2心肌細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、A/R組、A/R并給予不同劑量(1、5、20、80μM)HSY

4、A干預(yù)組，MTT法檢測(cè)各組H9c2心肌細(xì)胞活力，酶聯(lián)免疫分析法檢測(cè)各組H9c2心肌細(xì)胞上清液肌鈣蛋白Ⅰ濃度，蛋白免疫印跡技術(shù)測(cè)定各組H9c2心肌細(xì)胞HO-1蛋白表量。然后用隨機(jī)分成的對(duì)照組、A/R組、A/R并給予HSYA20μM干預(yù)組、HO-1抑制劑(ZnPP-Ⅸ)組繼續(xù)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，測(cè)定各組H9c2心肌細(xì)胞的HO-1酶活力，F(xiàn)ITC-Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組H9c2心肌細(xì)胞的凋亡率，蛋白免疫印跡技術(shù)測(cè)定各組H9c

5、2心肌細(xì)胞HO-1蛋白表量、裂解的caspase-3(CC3)表達(dá)量和細(xì)胞線(xiàn)粒體Bcl-2/Bax比值。
　　 結(jié)果：⑴HSYA提高了經(jīng)歷A/R的H9c2心肌細(xì)胞的活力。⑵HSYA減輕了經(jīng)歷A/R的H9c2心肌細(xì)胞的損傷。⑶HSYA上調(diào)了經(jīng)歷A/R的H9c2心肌細(xì)胞的HO-1表達(dá)。⑷ZnPP-Ⅸ對(duì)HSYA上調(diào)經(jīng)歷A/R的H9c2心肌細(xì)胞的HO-1表達(dá)的作用沒(méi)有明顯影響。⑸HSYA上調(diào)經(jīng)歷A/R的H9c2心肌細(xì)胞HO-1的酶活力被

6、ZnPP-Ⅸ抑制。⑹HSYA抗A/R誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞凋亡的作用被ZnPP-Ⅸ部分消除。⑺ZnPP-Ⅸ部分地消除了HSYA上調(diào)經(jīng)歷A/R的H9c2心肌細(xì)胞線(xiàn)粒體Bcl-2/Bax比值的作用。⑻ZnPP-Ⅸ部分地消除了HSYA降低經(jīng)歷A/R的H9c2心肌細(xì)胞CC3表達(dá)量的作用。
　　 結(jié)論：HSYA通過(guò)上調(diào)HO-1的表達(dá)量和酶活力抑制A/R誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡從而減輕了細(xì)胞損傷。
　　 第二部分：羥基紅花黃素A上調(diào)

7、經(jīng)歷缺氧/復(fù)氧的H9c2心肌細(xì)胞血紅素氧合酶-1的表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　 目的：利用體外A/R模擬體內(nèi)缺血再灌注誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞凋亡，并給予HSYA干預(yù)，探討HSYA在抗A/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡作用中上調(diào)HO-1表達(dá)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路機(jī)制。
　　 方法：H9c2心肌細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、A/R組、HSYA20μM干預(yù)組、HO-1抑制劑組，蛋白免疫印跡技術(shù)測(cè)定各組H9c2心肌細(xì)胞p-ERK1/2、p-Akt蛋白表量。

8、然后用隨機(jī)分成的對(duì)照組、A/R組、HSYA20μM干預(yù)組、PI3K抑制劑(LY294002)組繼續(xù)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，蛋白免疫印跡技術(shù)測(cè)定各組H9c2心肌細(xì)胞p-Akt、HO-1、CC3蛋白表量和各組H9c2心肌細(xì)胞核蛋白中Nrf2的量。
　　 結(jié)果：⑴HSYA和ZnPP-Ⅸ對(duì)經(jīng)歷A/R的H9c2心肌細(xì)胞的ERK1/2的磷酸化沒(méi)有明顯影響。⑵HSYA促進(jìn)經(jīng)歷A/R的H9c2心肌細(xì)胞Akt磷酸化而ZnPP-Ⅸ對(duì)HSYA增強(qiáng)H9c2心肌細(xì)

9、胞Akt磷酸化的作用沒(méi)有明顯影響。⑶HSYA促進(jìn)經(jīng)歷A/R的H9c2心肌細(xì)胞Akt磷酸化的作用被LY294002阻斷。⑷LY294002部分地阻斷了HSYA上調(diào)經(jīng)歷A/R的H9c2心肌細(xì)胞HO-1表達(dá)的作用，并顯著地削弱了HSYA降低經(jīng)歷A/R的H9c2心肌細(xì)胞CC3表達(dá)量的作用。⑸HSYA促進(jìn)經(jīng)歷A/R的H9c2心肌細(xì)胞Nrf2向核內(nèi)轉(zhuǎn)位的作用被LY294002部分阻斷。
　　 結(jié)論：HSYA減輕細(xì)胞損傷可能機(jī)制之一是通過(guò)激活