Dock1對(duì)缺氧-復(fù)氧誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞凋亡和增殖的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：探討鳥苷酸交換因子Dock1對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞凋亡和增殖的影響及相關(guān)的分子機(jī)制。
　　方法：用陰性對(duì)照慢病毒（NC shRNA）和靶向Dock1基因沉默慢病毒（Dock1 shRNA）分別感染大鼠H9C2心肌細(xì)胞，用嘌呤霉素來篩選并建立慢病毒感染有效的細(xì)胞株。再用重組人Dock1過表達(dá)質(zhì)粒（hDock1-pCXN2-Flag）和重組真核空載質(zhì)粒（pCXN2-Flag）分別隨機(jī)轉(zhuǎn)染Dock1沉默細(xì)胞。將上述干預(yù)

2、后的三組細(xì)胞各備兩份，并隨機(jī)從中取一份進(jìn)行缺氧/復(fù)氧（H/R）干預(yù)。將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為6組：Ⅰ:陰性對(duì)照組（ NC shRNA）;Ⅱ:Dock1沉默+空質(zhì)粒組（ Dock1 shRNA）;Ⅲ:Dock1沉默+人Dock1過表達(dá)組（Dock1 shRNA+hDock1）;Ⅳ:陰性對(duì)照＋缺氧/復(fù)氧組（NC shRNA+H/R）Ⅴ:Dock1沉默+空質(zhì)粒＋缺氧/復(fù)氧組（Dock1 shRNA+H/R）;Ⅵ:Dock1沉默+人Dock1過表達(dá)＋缺氧

3、/復(fù)氧組（Dock1 shRNA+hDock1+H/R）。采用RT-PCR檢測(cè)Dock1 mRNA表達(dá)水平，Western blot法檢測(cè)Dock1、AKT、p-AKT、p-ERK1/2、Bcl-2、Bax和Flag蛋白表達(dá)水平，MTT法檢測(cè)各組增殖率，流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)各組凋亡率。
　　結(jié)果：細(xì)胞的慢病毒感染率達(dá)80％。與陰性對(duì)照組比較，Dock1沉默干預(yù)組Dock1 mRNA、Dock1蛋白、p-AKT蛋白、p-ERK1

4、/2蛋白、Bcl-2蛋白和細(xì)胞增殖率均顯著降低，而Bax蛋白和細(xì)胞凋亡率均顯著增加。與Dock1沉默組比較，Dock1沉默+過表達(dá)組存在human Dock1 mRNA表達(dá)，而rat Dock1 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Dock1蛋白、p-AKT蛋白、p-ERK1/2蛋白、Bcl-2蛋白和細(xì)胞增殖率均顯著增加， Bax蛋白和細(xì)胞凋亡率均顯著降低。與對(duì)應(yīng)正常條件培養(yǎng)各組比較， H/R干預(yù)各組的Dock1 mRNA、Dock1蛋白、p

5、-AKT蛋白、p-ERK1/2蛋白、Bcl-2蛋白和細(xì)胞增殖率均顯著降低，Bax蛋白和細(xì)胞凋亡率均顯著增加(所有P＜0.05）。
　　結(jié)論：在體外H9C2心肌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中：成功實(shí)現(xiàn)缺氧/復(fù)氧（缺血/再灌注）損傷模型；沉默Dock1基因可加重模型所致的凋亡增加和增殖降低，而過表達(dá)Dock1基因可逆復(fù)模型所致的上述損傷。因而得出結(jié)論：Dock1能抑制H9C2心肌細(xì)胞的凋亡、協(xié)助其增殖，且和Dock1的表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系，這種作用是通過