缺氧抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β1誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)變.pdf

1、纖維化的重要特征是細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）的沉積，肌成纖維細(xì)胞是ECM的主要來源。缺氧或缺氧/復(fù)氧均可導(dǎo)致心肌纖維化，引起心肌層中轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1）高表達(dá)。缺氧復(fù)氧會上調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子E47（Transcription Factor-3，TCF-3）的活性。TGF-β1是纖維化過程中的重要調(diào)控因子，通過上調(diào)E47，進(jìn)而引起上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)

2、型（epithelial mesenchymal transition，EMT），誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變。目前缺氧對心肌纖維化的研究主要集中在成纖維細(xì)胞的表型去分化中，那么心肌細(xì)胞本身在缺氧的作用下，是否會上調(diào)TGF-β1，繼而通過核轉(zhuǎn)錄因子E47介導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生肌成纖維細(xì)胞化的表型轉(zhuǎn)變，從而主動參與到心肌纖維化的過程中呢？為此，我們分別觀察了缺氧、缺氧復(fù)氧和TGF-β1對心肌細(xì)胞株H9c2表型轉(zhuǎn)變的影響及其相互作用，以及利用

3、肌成纖維細(xì)胞的特異性標(biāo)志物α-SMA作為評價(jià)指標(biāo)，確認(rèn)心肌細(xì)胞是否向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變；以及利用TGF-β1抑制劑SB431542，判斷TGF-β1和E47的上下游關(guān)系；利用E47和p-AKT直接免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測E47的磷酸化；并且觀察缺氧和TGF-β1同時(shí)作用過程中TGF-β1主要的下游信號通路Smad、MAPK和RhoA家族的表達(dá)情況。
　　方法：
　　1. TGF-β1誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)：給予H9c2細(xì)胞不同濃度（1、5、10、

4、20、30 ng/ml）和不同時(shí)間（6、12、24、32、48 h）的TGF-β1誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，觀察H9c2細(xì)胞中E47和α-SMA的表達(dá)。
　　2.缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)：對H9c2細(xì)胞進(jìn)行不同時(shí)間的缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，缺氧1h復(fù)氧1h;缺氧1h復(fù)氧2h;缺氧2h復(fù)氧1h;缺氧2h復(fù)氧2h;缺氧3h復(fù)氧1h;缺氧3h復(fù)氧2h觀察H9c2細(xì)胞中E47和α-SMA的表達(dá)。
　　3. TGF-β1抑制劑SB431542干擾實(shí)驗(yàn)：預(yù)給TGF-

5、β1抑制劑SB431542半小時(shí)后，缺氧3h復(fù)氧2h，觀察H9c2細(xì)胞中E47的表達(dá)。
　　4. E47的磷酸化檢測實(shí)驗(yàn)：缺氧3h復(fù)氧2h后直接免疫共沉淀法觀察E47與p-AKT的相互作用，E47是否發(fā)生磷酸化。
　　5.缺氧誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)：對H9c2細(xì)胞進(jìn)行不同時(shí)間（1、2、3、4 h）的缺氧誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，觀察H9c2細(xì)胞中TGF-β1的表達(dá)。并對H9c2細(xì)胞進(jìn)行不同時(shí)間（5、15、30、45、60 min，2、3、4 h）的缺氧誘

6、導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，觀察H9c2細(xì)胞中α-SMA的表達(dá)。
　　6. TGF-β1+缺氧誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)：在H9c2細(xì)胞培養(yǎng)液中加入TGF-β1的同時(shí)進(jìn)行不同時(shí)間（1、2、3、4 h）的缺氧誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，觀察H9c2細(xì)胞中α-SMA的表達(dá)。
　　7.信號通路的影響：觀察缺氧對TGF-β1下游信號通路Smad、MAPK和RhoA家族表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　1. TGF-β1可以劑量和時(shí)間依賴的促進(jìn)E47和α-SMA的表達(dá)。5 ng/m

7、l TGF-β1作用24 h，可以誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞中α-SMA的表達(dá)達(dá)到峰值。10 ng/ml TGF-β1作用24 h，可以誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞中E47的表達(dá)達(dá)到峰值。
　　2.隨著缺氧復(fù)氧的時(shí)間延長，E47的表達(dá)逐漸增高，并缺氧3h復(fù)氧2h時(shí) E47的表達(dá)達(dá)到峰值。而α-SMA的表達(dá)沒有顯著性變化。
　　3.給予TGF-β1抑制劑SB431542后，會抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的E47表達(dá)上調(diào)。
　　4.缺氧3h復(fù)氧2h，E47

8、和α-SMA并沒有明顯的結(jié)合條帶，表明E47并沒有發(fā)生磷酸化。
　　5.單純?nèi)毖跽T導(dǎo)，H9c2細(xì)胞中TGF-β1的表達(dá)在3~4 h表達(dá)增高；而α-SMA的表達(dá)沒有顯著性變化。
　　6.給予TGF-β1同時(shí)缺氧，發(fā)現(xiàn)隨著缺氧時(shí)間增加，α-SMA的表達(dá)逐漸降低至Control組水平。
　　7.給予TGF-β1同時(shí)缺氧，p-Smad2/3和p-RhoA會隨著缺氧時(shí)間延長而逐漸減低。而p-ERK先減低后增高，p-JNK和p-P