白藜蘆醇干預(yù)缺血后處理對(duì)H9c2(2-1)心肌細(xì)胞壞死率及p38MAPK-PPARγ途徑的研究.pdf

1、目的：
　　 將具有天然心血管保護(hù)作用的PPARγ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma)激活劑——白藜蘆醇(Resveratrol，RSV)與減輕再灌損傷的有效手段——缺血后處理(Ischemic Postconditioning，IPO)聯(lián)合作用于受損心肌細(xì)胞，觀察聯(lián)合后的保護(hù)效果，并通過對(duì)應(yīng)激保護(hù)途徑關(guān)鍵酶p38 MAPK變化、p38 MAPK下游分子PPARγ變

2、化、PPARγ下游分子AP-1變化的測(cè)定，探討RSV聯(lián)合IPO的作用機(jī)制。驗(yàn)證假設(shè)：RSV可以通過改善p38 MAPK信號(hào)通路增加PPARγ表達(dá)，降低AP-1表達(dá)來增強(qiáng)IPO對(duì)再灌損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　 方法：
　　 購(gòu)得H9c2(2-1)細(xì)胞株并于含10％FBS的DMEM中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)為80％時(shí)：細(xì)胞分為對(duì)照組(C組)、I/R組、RSV+I/R組、IPO組、RSV+IPO組。C組：不處理；I/R組：模擬缺血

3、培養(yǎng)基和復(fù)血培養(yǎng)基進(jìn)行I/R；RSV+I/R組：RSV干預(yù)20min后給予I/R；IPO組：模擬缺血培養(yǎng)基和復(fù)血培養(yǎng)基進(jìn)行IPO；RSV+IPO組：RSV干預(yù)20min后給予IPO。
　　 1.IPO實(shí)驗(yàn)IPO干預(yù)細(xì)胞后0h、12h、24h分別利用AO-EB法測(cè)定細(xì)胞平均壞死率，分別觀察RSV單獨(dú)和聯(lián)合IPO時(shí)減輕心肌細(xì)胞I/R損傷的作用。
　　 2.RSV聯(lián)合IPO對(duì)p38 MAPK/PPARγ/AP-1通路影響IPO

4、后12h，利用Western blotting技術(shù)檢測(cè)p38 MAPK蛋白表達(dá)、磷酸化情況，PPARγ、AP-1蛋白表達(dá)情況。采用半定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)p38 MAPK、cyclinA2 mRNA表達(dá)情況。觀察RSV干預(yù)后再進(jìn)行IPO時(shí)MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的變化。
　　 3.p38 MAPK抑制劑對(duì)保護(hù)作用及上述通路的影響在以上五組基礎(chǔ)上增加RSV+SB+IPO組。RSV+SB+IPO組：給予p38 MAPK抑制劑SB203

5、58020min，RSV20min，給予IPO。IPO后12h，利用AO-EB法測(cè)定細(xì)胞平均壞死率，Western blotting技術(shù)檢測(cè)PPARγ、AP-1蛋白表達(dá)情況。采用半定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)cyclinA2 mRNA表達(dá)情況。觀察抑制p38 MAPK對(duì)RSV聯(lián)合IPO的保護(hù)作用的影響，以及下游分子PPARγ、AP-1蛋白表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.RSV單獨(dú)和聯(lián)合IPO時(shí)均可減輕心肌細(xì)胞I/R損傷用

6、IPO干預(yù)H9c2(2-1)細(xì)胞0h、12h、24h后，各時(shí)間點(diǎn)IPO組細(xì)胞平均壞死率均低于I/R組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。0h到12h呈增加趨勢(shì)，12h到24h趨于平穩(wěn)，并稍有降低。IPO組和RSV組細(xì)胞平均壞死率均低于I/R組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。RSV+IPO組細(xì)胞平均壞死率分別低于IPO和RSV單獨(dú)作用，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2 RSV聯(lián)合IPO對(duì)p38 MAPK

7、/PPARγ/AP-1通路影響p38 MAPK蛋白水平：IPO后0h，IPO組高于I/R組。12h時(shí)，IPO組低于I/R組，24h時(shí)進(jìn)一步降低，RSV+IPO組低于I/R組和C組，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。p38 MAPKmRNA變化與p38 MAPK蛋白水平變化趨勢(shì)一致。12h時(shí)p38 MAPK磷酸化水平：IPO組低于I/R組，RSV+IPO組低于IPO組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 PPARγ

8、蛋白水平：I/R組與C組無差異，IPO組高于I/R組，RSV+IPO組高于IPO組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；AP-1蛋白水平：I/R組低于C組，IPO組低于I/R組，RSV+IPO組低于IPO組，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。12h時(shí)cyclinA2mRNA：IPO組高于I/R組和C組，RSV+IPO組高于IPO組，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3 p38 MAPK抑制劑對(duì)保護(hù)作用及上述

9、通路的影響細(xì)胞平均壞死率：SB+RSV+IPO組高于RSV+IPO組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。PPARγ蛋白水平：SB+RSV+IPO組低于RSV+IPO組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。AP-1蛋白水平：SB+RSV+IPO組高于RSV+IPO組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。cyclinA2 mRNA：SB+RSV+IPO組與RSV+IPO組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。cyclinA2蛋白：SB+RSV+IPO組低于

10、RSV+IPO組。
　　 結(jié)論：
　　 1、IPO后0-24h，RSV單獨(dú)和聯(lián)合IPO時(shí)均可減輕心肌細(xì)胞細(xì)胞平均壞死率，聯(lián)合IPO時(shí)可促進(jìn)IPO對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　 2、與IPO比較：RSV聯(lián)合IPO可降低p38 MAPK、磷酸化p38 MAPK和AP-1表達(dá)，升高PPARγ及cyclinA2表達(dá)。RSV通過改善p38 MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)了IPO對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　 3、p38MAPK