Notch信號通路參與bFGF對神經(jīng)干細(xì)胞輻射損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、放射性腦損傷(radiation injuries，brain,RIB)及其隨之而來的放射性腦病是由于利用射線治療頭頸部的腫瘤后，造成的臨近腦組織的直接或者間接損害及其損害所產(chǎn)生的相應(yīng)并發(fā)癥?；颊哳净碱^部或者頸部的腫瘤后，至本病的中后期往往需要進(jìn)行放射治療，經(jīng)過一定的潛伏期后大多數(shù)患者會產(chǎn)生神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，這種損傷一旦形成后損害往往很難逆轉(zhuǎn)，嚴(yán)重影響著患者的健康與生存質(zhì)量。RIB發(fā)病機(jī)制目前尚無定論，目前的研究大部分集中到血管、細(xì)胞及免

2、疫反應(yīng)等諸多方面，例如血管結(jié)構(gòu)的破壞，細(xì)胞組分的變性與壞死以及自身免疫物質(zhì)的產(chǎn)生等。目前對放射性腦病的治療方法較多，臨床上以脫水降顱壓、營養(yǎng)腦神經(jīng)等治療，雖然藥物眾多，但治療效果往往一般且多缺乏明顯的對因治療。近年來，細(xì)胞因子、基因等新興方法的出現(xiàn)為RIB的治療提供了及其廣泛的前景。
　　Notch是一種細(xì)胞受體蛋白，它幾乎存在于大多數(shù)的細(xì)胞中，特別是增殖能力較強(qiáng)的細(xì)胞中，它在信號傳遞過程中扮演著重要的角色，相鄰細(xì)胞之間通過Not

3、ch信號通路的調(diào)控，影響著動植物的生長與發(fā)育，Notch信號通路及其保守。無論是在高等生物中還是在低等的生物中Notch信號通路都發(fā)揮著重要的作用，細(xì)胞的增生與分化，神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育完全及器官等形成都離不開Notch信號通路。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究表明中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在Notch-Hes信號傳遞系統(tǒng)，這種系統(tǒng)可以抑制神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，維持神經(jīng)干細(xì)胞的生長與增殖。
　　γ-分泌酶是生物體內(nèi)一種及其重要的酶類，它在Notch信號

4、通路中處于顯著的地位，隨著人工合成技術(shù)的不斷提高，人們發(fā)現(xiàn)了一種重要的化合物—DAPT，它是一種抑制物，能夠明顯的抑制γ-分泌酶，有效地減弱這種酶的活性，特異的阻斷Notch通路的表達(dá)。DAPT的研究多集中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病，已有很多研究證實(shí)DAPT能夠抑制體外細(xì)胞的增殖，且存在著明顯的劑量依賴性。HES1基因是Notch受體蛋白下游的基因之一，已有研究表明利用DAPT處理HeLa細(xì)胞后，可以檢測到HeLa細(xì)胞中Notch1的mRNA

5、表達(dá)含量減少，由于Notch1表達(dá)的減少，其下游目標(biāo)基因HES1的表達(dá)也會相應(yīng)的減少。
　　bFGF是一種具體作用機(jī)制尚不太明確的神經(jīng)生長因子，它在新生血管的形成、創(chuàng)傷組織的修復(fù)與愈合過程中都有舉足輕重的意義，在神經(jīng)系統(tǒng)方面，其作用主要是促進(jìn)對神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增殖活性，在周圍神經(jīng)方面促進(jìn)損傷組織的再生。目前關(guān)于bFGF的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的作用機(jī)制已研究得比較清楚，主要包含:Ras/Raf/MEK/ERK、PKC、PI3K、JAK

6、/STAT等重要途徑。
　　為更好地明確外源性bFGF治療RIB的作用機(jī)制，了解Notch信號通路與bFGF抗輻射作用之間的關(guān)系，以C17.2神經(jīng)干細(xì)胞(C17.2NSCs)為工具細(xì)胞，建立放射性神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcells,NSCs)放射性損傷模型后，采用堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)分別與Notch信號通路的阻斷劑DAPT處理接受放射損傷后C17.2NSCs及射線處理后的細(xì)胞，觀察細(xì)胞的生長與增殖，檢測Not

7、ch信號通路下游基因即Notch1，RBP-Jκ，Hes1，Hash1基因的表達(dá)，探討Notch信號通路與外源性堿性成纖維細(xì)胞生長因子之間相互作用的可能機(jī)制。不但有助于闡明繼發(fā)性放射性神經(jīng)系統(tǒng)損傷的復(fù)雜病理過程，且有希望為放射性神經(jīng)系統(tǒng)損傷尋找出新的治療靶點(diǎn)，從而為設(shè)計(jì)出新型的阻斷劑或特定部位的靶點(diǎn)信號分子的激活劑，等治療藥物等，為人類造福。
　　目的：
　　1.建立C17.2 NSC放射性損傷模型后觀察不同時(shí)期Notch1

8、，RBP-Jκ，Hes1，Hash1表達(dá)情況的差異。
　　2.在bFGF參與對C17.2 NSC保護(hù)的情況下，觀察不同時(shí)期上述節(jié)點(diǎn)分子的表達(dá)情況，并做對比分析。
　　3.加入γ-分泌酶抑制劑DAPT觀察C17.2 NSC放射性模型細(xì)胞不同時(shí)期的凋亡、壞死及增殖分化情況。
　　研究方法：
　　1.C17.2神經(jīng)干細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)
　　2.C17.2神經(jīng)干細(xì)胞Nestin免疫細(xì)胞化學(xué)染色
　　3.MTT法檢測

9、細(xì)胞活性
　　4.放射誘導(dǎo)C17.2神經(jīng)干細(xì)胞凋亡及bFGF的保護(hù)作用和DAPT等的影響
　　各種蛋白表達(dá)檢測:
　　(1)細(xì)胞免疫化學(xué)熒光染色
　　(2)提取細(xì)胞總蛋白并檢測含量
　　1.細(xì)胞總蛋白的提取
　　2.酶標(biāo)儀檢測蛋白含量
　　3.Western Blot檢測
　　結(jié)果：
　　1.正常細(xì)胞培養(yǎng):細(xì)胞接種后于第二日上午于顯微鏡下觀察，細(xì)胞貼壁生長，大部分細(xì)胞呈三角形，不規(guī)則

10、形，或圓形，多邊形，細(xì)胞有較長的突起，相鄰細(xì)胞之間突起可以相連，細(xì)胞培養(yǎng)約2-3天后，細(xì)胞貼滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶。
　　2.對細(xì)胞進(jìn)行免疫組化染色，神經(jīng)干細(xì)胞中nestin蛋白抗原與抗體結(jié)合，結(jié)果顯示經(jīng)過細(xì)胞免疫組化染色后98％以上的細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)被染成棕色，蘇木素復(fù)染后細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)棕色。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)7-8代后，免疫組化染色陽性率仍在90％以上。
　　3.從MTT OD結(jié)果表明，加入DAPT，神經(jīng)干細(xì)胞的生長受限，且其濃度的越高

11、，MTT OD值則越低，也即隨著DAPT濃度的升高，細(xì)胞的生長抑制程度增加，加入堿性成纖維細(xì)胞生長因子后，與單純DAPT組各組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05），即DAPT抑制細(xì)胞的生長，而堿性成纖維細(xì)胞能夠減輕這種抑制作用，且存在著明顯的劑量依賴性。
　　4.經(jīng)射線照射后MTT結(jié)果顯示與正常對照組（未經(jīng)射線照射）相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05），即射線能夠損傷神經(jīng)干細(xì)胞，抑制神經(jīng)干細(xì)胞的生長;細(xì)胞在96孔板中貼壁

12、生長后，加入不同設(shè)計(jì)濃度的DAPT后繼續(xù)培養(yǎng)，一段時(shí)間后利用射線照射，MTT結(jié)果表明各組與空白對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05），加入不同濃度DAPT并經(jīng)過射線處理后的各組與僅經(jīng)過射線處理后組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。DAPT能夠協(xié)同射線共同作用與神經(jīng)干細(xì)胞，進(jìn)一步抑制神經(jīng)干細(xì)胞的生長，且隨著DAPT濃度的升高，抑制作用愈強(qiáng)。成纖維細(xì)胞生長因子+DAPT+射線組與相同濃度的DAPT+射線處理組相比，各組之間均有

13、統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05），前組的MTT結(jié)果的OD值明顯高于后者，即堿性成纖維細(xì)胞生長因子能夠?qū)笵APT及射線對神經(jīng)干細(xì)胞的損傷作用，促進(jìn)細(xì)胞的生長與增值，對神經(jīng)干細(xì)胞有保護(hù)作用。
　　5.利用流式細(xì)胞儀檢測神經(jīng)干細(xì)胞的生長于增殖，結(jié)果顯示，與未經(jīng)任何處理的組相比，照射組細(xì)胞的凋亡率及細(xì)胞死亡率均明顯高于正常對照組。各組細(xì)胞貼壁生長后加入不同濃度的DAPT，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24h后再利用射線進(jìn)行處理，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，隨著DA

14、PT濃度的升高，細(xì)胞的凋亡率及死亡率明顯增加，各組間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05）。不同DAPT組與單純照射組相比，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05）。成纖維細(xì)胞生長因子+DAPT+射線組與相同濃度的DAPT+射線處理組相比，各組之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05），前組的細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞死亡率明顯低于后者。
　　6.細(xì)胞經(jīng)過免疫熒光染色后結(jié)果顯示，神經(jīng)干細(xì)胞中存在Hes1及RBP-Jκ蛋白。細(xì)胞胞質(zhì)在電子顯微鏡現(xiàn)觀察呈

15、現(xiàn)亮綠色。
　　7.Western結(jié)果顯示照射處理后的神經(jīng)干細(xì)胞隨bFGF濃度的升高RBP-Jκ蛋白的表達(dá)逐漸降低，而Hes1蛋白含量則逐漸升高;照射處理后的神經(jīng)干細(xì)胞隨DAPT濃度的升高RBP-Jκ蛋白的表達(dá)逐漸升高，而Hes1蛋白含量則逐漸降低;成纖維細(xì)胞生長因子+DAPT+射線組與相同濃度的DAPT+射線處理組相比，RBP-Jκ蛋白的表達(dá)降低，而Hes1蛋白含量則逐漸升高。
　　結(jié)論：
　　1.DAPT能夠抑制C