大鼠視網(wǎng)膜Muller細(xì)胞的神經(jīng)干細(xì)胞特性及其Wnt和Notch信號(hào)通路調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　 1.對(duì)視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法加以改良,建立簡(jiǎn)單快捷的分離培養(yǎng)Müller細(xì)胞的方法。
　　 2.通過體外去分化誘導(dǎo),探討大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞干細(xì)胞潛能的激活條件及調(diào)控機(jī)制。
　　 3.研究Wnt和Notch信號(hào)通路在Müller細(xì)胞去分化的調(diào)控作用。
　　 方法：
　　 1.取新生5—7天SD大鼠,顯微鏡下分離視網(wǎng)膜,直接吹打成微小組織懸液后置于含10％胎牛血清(

2、fetal bovine serum,FBS)的DMEM/F12(1:1)培養(yǎng)基中培養(yǎng),8-10天后行第一次換液,之后2-3天換液一次至細(xì)胞完全融合后進(jìn)行傳代。免疫熒光組織化學(xué)檢測(cè)Müller細(xì)胞標(biāo)志物谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)和波形蛋白(Vimentin)的表達(dá)進(jìn)行細(xì)胞鑒定,使用FACS對(duì)所得細(xì)胞進(jìn)行純度檢測(cè)。
　　 2.取第3代視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞,更換含DMEM/F12(1:1.),

3、1×N2 supplement,2× B27 supplement,20 ng/ml表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF),10ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的無血清去分化培養(yǎng)基培養(yǎng)3-5天。倒置相差顯微鏡下觀察去分化后細(xì)胞的形態(tài)特征,免疫熒光組織化學(xué),Real time RT-PCR以及Western blotting檢測(cè)神經(jīng)干

4、細(xì)胞標(biāo)志物Nestin,Musashi-1以及視網(wǎng)膜干細(xì)胞標(biāo)志物Pax6的表達(dá)情況。CCK-8法檢測(cè)去分化后細(xì)胞的增殖能力。更換含1×N2 supplement,2×B27 supplement,10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基對(duì)去分化后的細(xì)胞進(jìn)行再分化誘導(dǎo),免疫熒光組織化學(xué)檢測(cè)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的表達(dá)情況。
　　 3.Real time RT-PCR

5、檢測(cè)Wnt和Notch信號(hào)通路的相關(guān)分子Fzd1,Fzd2,Lef1,Notch1,Delta1和Hes1在Müller細(xì)胞去分化培養(yǎng)前后的mRNA水平,并于去分化培養(yǎng)的第0,1,2,3,4,5天分別收集細(xì)胞行Western blotting檢測(cè)Wnt2,β-catenin,Notch1,Pax6和Nestin的蛋白水平。
　　 4.使用通路激動(dòng)劑(Wnt-3a,Notch1)和抑制劑(Dkk-1,DAPT)對(duì)Müller去分化

6、培養(yǎng)過程中的Wnt和Notch信號(hào)通路進(jìn)行干預(yù),觀察Müller細(xì)胞去分化的情況,FACS檢測(cè)各組去分化前后視網(wǎng)膜干細(xì)胞標(biāo)志物Pax6陽(yáng)性細(xì)胞的百分率。CCK-8檢測(cè)各組中神經(jīng)球細(xì)胞的自我增殖能力。
　　 結(jié)果:
　　 1.原代培養(yǎng)的Müller細(xì)胞胞體狹長(zhǎng),胞漿豐富,免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示,97.2±1.43％的細(xì)胞GS染色陽(yáng)性,90.3±2.17％的細(xì)胞Vimentin染色陽(yáng)性。流式細(xì)胞檢測(cè)顯示傳3代后的細(xì)胞99.7％

7、GS表達(dá)陽(yáng)性。
　　 2.去分化培養(yǎng)3—5天后,大部分Müller細(xì)胞克隆生長(zhǎng)成神經(jīng)球狀,免疫熒光組織化學(xué)檢測(cè)顯示,細(xì)胞球Nestin,Musashi-1及Pax6染色陽(yáng)性。Real time RT-PCR的結(jié)果顯示,細(xì)胞球中Pax6的mRNA水平較Müller細(xì)胞增加了～5.57倍,Nestin的mRNA水平增加了～3.98倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。Western blotting結(jié)果顯示,神經(jīng)球細(xì)胞中的Pax6和

8、Nestin的蛋白表達(dá)水平較Müller細(xì)胞有明顯升高。FACS結(jié)果顯示,去分化前的Müller細(xì)胞中Pax6和Nestin的陽(yáng)性率分別為7.8％和7.3％,去分化后的細(xì)胞為80.2％和60.4％。CCK-8檢測(cè)顯示,神經(jīng)球細(xì)胞可以自我增殖,同時(shí)經(jīng)再分化誘導(dǎo)培養(yǎng)后表達(dá)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP。
　　 3.Real time RT-PCR結(jié)果顯示,神經(jīng)球細(xì)胞中Wnt和Notch通路相關(guān)基因的mRNA水平較Müller細(xì)胞明顯升高,其

9、中Fzd1為～2.44倍,Fzd2為～2.82倍,Lef1為～4.62倍,Notch1為～3.24倍,Delta1為～2.64倍,Hes1為～5.71倍,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。Western blotting結(jié)果顯示,從d0到d5,Wnt2,β-catenin,Notch1,Pax6和Nestin蛋白的表達(dá)逐漸增強(qiáng),通路相關(guān)蛋白Wnt2,β-catenin及Notch1與干細(xì)胞標(biāo)志物Pax6及Nestin的表達(dá)存在時(shí)間的一

10、致性。
　　 4.在添加Wnt-3a和Notch1組中,神經(jīng)球的數(shù)量明顯增加,體積增大,添加Dkk-1和DAPT組中,神經(jīng)球數(shù)量較少,細(xì)胞增殖緩慢。FACS結(jié)果顯示,在Wnt-3a+Notch1組中,Pax6陽(yáng)性的細(xì)胞為94.1％,Wnt-3a組中為87.1％,Notch1組中為76.2％,均較對(duì)照組的63.7％有所升高,在Dkk-1組中Pax6陽(yáng)性細(xì)胞為38.4％,DAPT組中為31.7％,均較對(duì)照組明顯下降。CCK-8檢測(cè)結(jié)

11、果顯示,在Wnt-3a+Notch1組,Wnt-3a組和Notch1組中,細(xì)胞增殖速度均較對(duì)照組快,在Dkk-1組和DAPT組中,細(xì)胞增殖速度較對(duì)照組下降。
　　 結(jié)論:
　　 1.改良后的培養(yǎng)方法可以簡(jiǎn)單快捷的分離純化視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞。
　　 2.生長(zhǎng)因子的刺激可以在體外激活視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的干細(xì)胞特性,Müller細(xì)胞很可能成為視網(wǎng)膜干細(xì)胞的一種潛在來源。
　　 3.Müller細(xì)胞去分化