Wnt信號通路介導(dǎo)的基因調(diào)控毛囊干細胞定向分化的研究.pdf

1、背景和目的：
　　毛囊干細胞(Hair follicle stem cells，HFSCs)被選為種子細胞用于構(gòu)建組織工程皮膚以修復(fù)臨床燒傷、創(chuàng)傷、慢性潰瘍等皮膚缺失已成為醫(yī)學(xué)研究的熱點。毛囊是皮膚的重要附屬器官，從內(nèi)向外依次由毛干、內(nèi)根鞘和外根鞘組成。毛囊隆突部位于外根鞘近表皮端，皮脂腺下方豎毛肌附著處，此處的細胞體外培養(yǎng)時表現(xiàn)出干細胞的特性，即可自我復(fù)制、慢周期性和具有多向分化潛能。目前已經(jīng)得到證實，隆突部的這一群特殊的細胞為

2、毛囊干細胞。毛囊干細胞具有多向分化遷移能力，不僅能向上分化并遷移參與表皮更新和皮脂腺維持，而且能向下端毛球部分化并遷移參與形成毛囊。毛囊干細胞分化傾向的不同是由多種因素共同決定的，不僅有細胞內(nèi)部分子及基因的調(diào)控，也有外來信號及微環(huán)境壁龕的協(xié)同作用，更有多條信號通路傳導(dǎo)分化“命令”。在眾多科研工作者的共同努力下發(fā)現(xiàn)，毛囊干細胞Wnt信號通路(Wnt signaling pathway)在調(diào)控其增殖、分化中起到重要作用。
　　Wnt/

3、β-catenin信號通路在全身幾乎所有的細胞中都存在，細胞受到刺激后釋放Wnt蛋白，激活下游一系列大分子信號活性物質(zhì)，最終導(dǎo)致基因表達改變，是誘導(dǎo)細胞分化和增殖的一條分子級聯(lián)通路，在胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生中，這條通路也起到關(guān)鍵性的作用。在HFSCs中，Wnt/β-catenin信號通路激活后會引起β-catenin在胞漿內(nèi)的堆積，隨之轉(zhuǎn)入到細胞核中，與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子Tcf3/Lefl結(jié)合，激活下游靶基因c-myc、cyclin D1等的轉(zhuǎn)錄

4、，促進毛囊干細胞定向分化。近年來有研究發(fā)現(xiàn)細胞外來干預(yù)因子氯化鋰(LiCl)可抑制Wnt信號通路中β-catenin的降解，使之在細胞質(zhì)中聚集，激活下游通路，影響毛囊干細胞分化的表型，但對于LiCl調(diào)節(jié)HFSCs分化的分子機制研究較少，且局限于在細胞質(zhì)中作用的研究。本課題選用了氯化鋰激活Wnt信號通路，探討Wnt/β-catenin信號通路在人HFSCs向毛囊形成細胞或表皮細胞定向分化中的作用及與其他信號因子的相互關(guān)系，尤其是細胞核內(nèi)的

5、分子水平改變，以及藥物控釋系統(tǒng)的建立和在組織工程皮膚中的應(yīng)用。
　　方法：
　　1.頭皮組織采用改進的毛囊隆突部獲取方法及兩步酶消化后，將帶有隆突部的毛發(fā)剪成泥狀，Ⅳ型膠原差速貼壁法獲取毛囊干細胞。使用免疫熒光染色法對毛囊干細胞進行鑒定。以500個/孔(2.5×103/m1)、1000個/孔(5×103/m1)、2000個/孔(1×104/m1)、3000個/孔(1.5×104/m1)、5000個/孔(2.5×104/m1)

6、接種于96孔培養(yǎng)板中，觀察細胞生長情況，采用MTT法描繪其生長曲線，觀察各密度培養(yǎng)的HFSCs在不同時間點的增殖效應(yīng)，篩選出體外最佳的HFSCs傳代培養(yǎng)密度。
　　2.選用0、0.1、1、5、10、20、40、100mM/l的氯化鋰誘導(dǎo)毛囊干細胞分化，觀察毛囊干細胞的生存狀態(tài)，確定氯化鋰的毒性作用范圍；選用0、5、10mM/l氯化鋰作用于毛囊干細胞，MTT法對比分析各組對細胞增殖效應(yīng)；LiCl終濃度分別為0、0.1、1、10、50

7、、100、200、400μg/ml作用于毛囊干細胞，檢測氯化鋰的毒性，并探索促HFSCs分化的最佳LiCl濃度；采用real-time PCR技術(shù)定量檢測0、5、10mmol/ml LiCl干預(yù)毛囊干細胞5d后Wnt信號通路中生物大分子：β-catenin、GSK-3β、Tcf3、c-myc和cyclin D1的mRNA水平，探討LiCl誘導(dǎo)HFSCs分化過程中，LiCl的不同濃度對Wnt/β-catenin信號途徑及其相關(guān)信號因子的表

8、達的影響和相互作用。
　　3.LiCl-PLGA納米微球的制備：選用聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)作為微囊敷料，荷載適當(dāng)濃度的氯化鋰，采用復(fù)乳-溶劑揮發(fā)法制備載有氯化鋰的納米微囊。完全培養(yǎng)基培養(yǎng)人成纖維細胞，選用異體脫細胞真皮(ADM)為支架材料，以擴增培養(yǎng)的HFSCs為種子細胞接種于ADM表皮面，成纖維細胞接種于ADM真皮面，構(gòu)建組織工程皮膚。采用5mM/l的LiCl干預(yù)構(gòu)建的組織工程皮膚，培養(yǎng)5d后切片行HE染色、免疫熒光染色和

9、免疫組織化學(xué)染色，觀察種子細胞在ADM上的生長及分化情況，為動物實驗奠定良好基礎(chǔ)。
　　結(jié)果：
　　1.從人頭皮成功分離培養(yǎng)出HFSCs，在體外經(jīng)多次傳代后仍具有很強的增殖能力和多向分化潛能，當(dāng)HFSCs接種密度為1x104ml時，細胞增殖速度最快，擴展能力強，其生長曲線呈典型的S型。
　　2.隨LiCl濃度升高，細胞增殖效應(yīng)減弱。含有LiCl的K-SFM條件培養(yǎng)基中HFSCs形態(tài)改變明顯，各組間有明顯差別，LiCl>

10、10mmol/L時分化比例高。LiCl誘導(dǎo)毛囊干細胞Wnt信號通路的同時還有其一定的細胞毒性，濃度大于200μg/ml(約5mmol/L)時明顯抑制細胞生長。實驗研究發(fā)現(xiàn)在HFSCs分化過程中，LiC l可激活Wnt/β-catenin信號通路，當(dāng)濃度為5mM/l時促使β-catenin及其拮抗物G SK3β、核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子Tcf3、下游基因c-myc、cyclin D1的轉(zhuǎn)錄上調(diào)，濃度為10 mM/l時除cyclin D1轉(zhuǎn)錄仍上調(diào)外，

11、其余基因轉(zhuǎn)錄下調(diào)。
　　3.掃描電鏡觀察細胞在PLGA-ADM材料上生長良好，分泌的胞外基質(zhì)豐富，并隨時間進展，細胞逐漸融合，細胞外基質(zhì)分泌逐漸增多。HE染色觀察發(fā)現(xiàn)H FSCs生長狀態(tài)良好，單層排列分布于ADM表皮面上，LiCl干預(yù)組表皮面有毛囊樣小凹形成，成纖維細胞與ADM真皮面貼附緊密，能分泌胞外基質(zhì)形成連續(xù)細胞層包繞ADM。
　　結(jié)論：
　　1.我們改進的培養(yǎng)方法能簡便快捷的獲取人HFSCs，且得到的人HFSC

12、s在體外有較強的增殖及傳代能力，1×104/ml接種密度是促進HFSCs增殖的最佳密度。
　　2.LiCl促HFSCs分化明顯，對HFSCs的干預(yù)有臨界毒性濃度，當(dāng)濃度大于200μg/ml時，細胞生長增殖受到明顯抑制，同時這一濃度也是促HFSCs分化的最佳濃度。LiCl促HFSCs分化作用可能與激活Wnt/β-catenin信號通路、通路下游各因子轉(zhuǎn)錄上調(diào)相關(guān)，Tcf3在維持細胞未分化狀態(tài)中發(fā)揮了一定的作用，cyclin D1的轉(zhuǎn)