骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對腸輻射損傷的修復(fù)作用.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells,MSCs)是從骨髓細(xì)胞分離出來的一種骨髓基質(zhì)非造血干細(xì)胞，具有很強(qiáng)的自我更新和多向分化的潛能，可以分化為多種間充質(zhì)組織，并可促進(jìn)間充質(zhì)組織的再生。它容易分離獲得，可在體外大量擴(kuò)增且仍保持增殖與分化潛能。此外，MSCs還具有歸巢的特性，炎癥對其有趨化作用，容易歸巢到炎癥、損傷部位。因此，MSCs被認(rèn)為是修復(fù)組織損傷的理想種子細(xì)胞。 輻射損傷發(fā)生在臨床腫瘤患者的放療及核恐怖

2、、核事故中，人體中細(xì)胞更新、代謝快的組織對輻射尤為敏感，如造血組織、腸道組織。目前直接針對輻射所致的腸道組織損傷尚缺乏有效的治療方法。輻射導(dǎo)致腸道組織的嚴(yán)重?fù)p傷，使消化道的物理屏障和免疫屏障功能喪失，以致腸腔內(nèi)毒性物質(zhì)和細(xì)菌進(jìn)入血循環(huán)和組織，引起感染，最后甚至導(dǎo)致多器官功能衰竭、死亡，在患者死亡中起決定性作用。 已有研究表明MSCs可修復(fù)心肌、肌肉、神經(jīng)等多種組織的損傷，但對修復(fù)腸輻射損傷方面的報(bào)道還較少。有學(xué)者觀察到，將綠色熒

3、光蛋白標(biāo)記的MSCs移植到全身照射的動(dòng)物模型中可在損傷的腸道等組織檢測到，說明MSCs能夠遷移定居到損傷的腸道組織?；谝陨涎芯拷Y(jié)果我們設(shè)計(jì)了本課題，首先制備一個(gè)腸輻射損傷的模型，通過移植體外擴(kuò)增、培養(yǎng)的骨髓MSCs，觀察MSCs對腸輻射損傷的修復(fù)作用。 目的： 通過建立小鼠腸輻射損傷模型，觀察小鼠骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞在小鼠腸道輻射損傷修復(fù)中的作用。 方法： 1.SPF級6-8周齡C57BL/6小鼠，本

4、實(shí)驗(yàn)中，輻射損傷模型制備為雌性C57BL/6小鼠，體外細(xì)胞培養(yǎng)、移植觀察全部用雄性C57BL/6小鼠。 2.利用MSCs體外貼壁生長的特性，體外培養(yǎng)C57BL/6雄性小鼠的骨髓MSCs獲得較純的骨髓MSCs，通過誘導(dǎo)其向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞分化的方法進(jìn)行鑒定。 3.將受鼠C57BL/6雌性小鼠隨機(jī)分成照射對照組(組I)、骨髓單個(gè)核細(xì)胞組(組II)和骨髓MSCs+骨髓單個(gè)核細(xì)胞組(組Ⅲ)，給予13.5Gy60Coγ射線全身致

5、死量照射建立腸輻射損傷模型，組I不做處理，組II2h內(nèi)通過尾靜脈移植C57BL/6雄性小鼠的骨髓單個(gè)核細(xì)胞106/ml，組Ⅲ2h內(nèi)通過尾靜脈移植骨髓MSCs106/ml和骨髓單個(gè)核細(xì)胞106/ml。觀察各組小鼠生存時(shí)間、4周的生存率、病理切片等指標(biāo)，并用PCR檢測雌性受鼠體內(nèi)Y染色體的sry基因，確定供體干細(xì)胞的植入情況。 4.應(yīng)用SPSS11.5軟件分析數(shù)據(jù)，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)或百分率表示，樣本均數(shù)間比較采用單向方

6、差分析(One-WayANOVA)，多重比較采用LSD(Lest-significantDifference)法。以Kaplan生存曲線描述各組小鼠生存時(shí)間。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1.予13.5Gy60Coγ射線全身致死量照射后小鼠出現(xiàn)明顯的脫毛，弓背，消瘦，活動(dòng)明顯減少，對刺激反應(yīng)減弱。取其小腸組織作病理切片，大體觀察見其腸壁明顯變薄，腸系膜充血、淤血，腸粘膜充血。HE染色后光鏡下可見大片小腸黏膜上

7、皮細(xì)胞壞死崩解，胞核腫脹淡染，上皮廣泛壞死剝脫，絨毛萎縮短禿，大量炎癥細(xì)胞侵潤，未見新生的腺窩細(xì)胞，符合腸損傷標(biāo)準(zhǔn)。 2.小鼠骨髓MSCs原代細(xì)胞培養(yǎng)48h后，首次換液，去除懸浮細(xì)胞，倒置顯微鏡下課件細(xì)胞貼壁，多呈圓形，培養(yǎng)至7-8d時(shí)，細(xì)胞呈梭形，可見大小不一的細(xì)胞克隆，呈漩渦狀生長，培養(yǎng)至10-11d時(shí)，細(xì)胞融合成單層，排列具有方向性，待細(xì)胞達(dá)80％融合時(shí)，即可傳代，傳代后細(xì)胞增迅速，雜質(zhì)細(xì)胞也進(jìn)一步被清除。在成脂誘導(dǎo)液加入

8、后72h，細(xì)胞中開始出現(xiàn)小脂滴，主要集中于細(xì)胞核周圍，隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長，脂滴逐漸聚集成大的脂泡，油紅O染色可見脂滴呈深橙紅色。在成骨培養(yǎng)基中維持培養(yǎng)25d左右，出現(xiàn)明顯高于周圍細(xì)胞表面的骨結(jié)節(jié)樣結(jié)構(gòu)，茜素紅染色顯示出明顯的紅色鈣結(jié)節(jié)。 3.組I的10只小鼠均于照射后7d死亡，平均生存時(shí)間為4.20天(4.20±0.79)，生存率0/10。組II的10只小鼠除2只于移植后7d死亡，其余均于移植后2周內(nèi)死亡，平均生存時(shí)間為11.00

9、天(11.00±2.31)，生存率0/10。組Ⅲ的10只小鼠中只有2只于28d內(nèi)死亡，其余存活時(shí)間超過了28d(視為長期存活)，平均生存時(shí)間為27.20天(27.20±1.75)，生存率8/10。采用單向方差分析比較各組間平均生存時(shí)間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=464.232，P<0.001)，采用LSD法分別比較組Ⅲ、組II、組I的生存時(shí)間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。病理切片顯示組II小鼠腸道黏膜損傷嚴(yán)重，與組I比較無明顯修復(fù)現(xiàn)

10、象，而組Ⅲ小鼠腸道黏膜結(jié)果基本正常，損傷有明顯修復(fù)現(xiàn)象。PCR檢測組Ⅲ小鼠小腸細(xì)胞內(nèi)有Y染色體特異性序列的存在，而檢測組II各小鼠的此基因片段均為陰性，證實(shí)雄性小鼠骨髓MSCs參與了受體小鼠的腸道修復(fù)。 結(jié)論： 1.給予C57BL/6小鼠13.5Gy60Coγ射線全身致死量照射后可制備出可靠的腸損傷動(dòng)物模型。 2.應(yīng)用密度梯度離心、貼壁培養(yǎng)法相結(jié)合的方法可以獲得較純的骨髓MSCs。 3.骨銹單個(gè)核細(xì)胞移植