低氧狀態(tài)下神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化的研究.pdf

1、神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cells, NSCs)是具有高度自我更新能力和多向分化潛能的神經(jīng)祖細(xì)胞(Neural progenitor cells, NPCs)。它能分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，因此對(duì)治療神經(jīng)退行性疾病和損傷有著廣闊的應(yīng)用前景，目前己成為神經(jīng)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。氧是生命存在的必要條件，也是細(xì)胞生理功能的一種重要調(diào)節(jié)因子，氧濃度的變化可影響細(xì)胞的功能狀態(tài)。目前關(guān)于低氧作用的研究多集中在對(duì)細(xì)胞的損傷和有關(guān)的適應(yīng)機(jī)制方面

2、，而對(duì)細(xì)胞增殖和分化中的作用研究較少，特別是低氧對(duì)NSCs增殖和分化的影響還存在爭(zhēng)議。促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin, EPO)是一種新的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)因子，有研究表明它在 NSCs增殖、分化中起著重要的調(diào)控作用，但它是否參與低氧時(shí)對(duì)NSCs增殖和分化進(jìn)行調(diào)節(jié)報(bào)道較少。因此，本研究利用細(xì)胞分子生物學(xué)手段，觀察低氧對(duì)NSCs增殖和分化的影響，檢測(cè)了低氧后NSCs及其分化細(xì)胞內(nèi)EPO的表達(dá)情況，并探討低氧狀態(tài)下EPO在誘導(dǎo)NS

3、Cs增殖和分化過程中的作用。
　　第一部分神經(jīng)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)和鑒定
　　目的：體外分離培養(yǎng)較高純度的NSCs。
　　方法：取孕13~14 d大鼠胚胎腦皮層，制成單細(xì)胞懸液，以1x105/ml密度接種、培養(yǎng)，于培養(yǎng)的第3d半量換液，換液前將聚集的細(xì)胞團(tuán)塊打散，于第7d取細(xì)胞球行Nestin鑒定。神經(jīng)干細(xì)胞分化后分別進(jìn)行GFAP和NSE鑒定。
　　結(jié)果： Nestin鑒定結(jié)果表明培養(yǎng)的細(xì)胞呈免疫反應(yīng)陽性，為神經(jīng)干細(xì)

4、胞，且較純。神經(jīng)干細(xì)胞分化細(xì)胞的NSE和GFAP鑒定表明，部分細(xì)胞呈NSE免疫反應(yīng)陽性，為神經(jīng)元、另一部分細(xì)胞為膠質(zhì)細(xì)胞。
　　結(jié)論：成功的培養(yǎng)出了神經(jīng)干細(xì)胞，且純度較高，可用于下面的實(shí)驗(yàn)。
　　第二部分低氧對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化的影響
　　目的：觀察低氧對(duì)NSCs增殖、分化的影響。
　　方法：將三代NSCs分為對(duì)照組和低氧組，分別置于5％ CO2培養(yǎng)箱和三氣培養(yǎng)箱(氧濃度為10%)中培養(yǎng)。采用克隆細(xì)胞球計(jì)數(shù)法、

5、MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況；神經(jīng)干細(xì)胞分化后行免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)細(xì)胞分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)的比率。
　　結(jié)果：細(xì)胞培養(yǎng)7 d時(shí)對(duì)照組和低氧組NSCs的克隆形成率分別為(21.26±2.16)%和(48.93±4.34)%。低氧組，神經(jīng)干細(xì)胞增殖活力 OD值明顯高于對(duì)照組；神經(jīng)干細(xì)胞分化成神經(jīng)元的比例比對(duì)照組高25.2%(p<0.05)。
　　結(jié)論：適度低氧能夠促進(jìn)NSCs增殖，促進(jìn)NSCs向神經(jīng)元方向分化。
　　第三部

6、分 EPO對(duì)低氧狀態(tài)下神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化的影響
　　目的：觀察低氧狀態(tài)下NSCs及其分化細(xì)胞EPO基因的表達(dá)情況，探討外源性EPO對(duì)低氧下NSCs增殖、分化的影響。
　　方法：低氧環(huán)境設(shè)置同第二部分。分別于低氧3h、6h、12h、24h、48h采用Western-blot檢測(cè)NSCs EPO蛋白的表達(dá)情況。胎牛血清誘導(dǎo)NSCs分化后，采用RT-PCR檢測(cè)EPO mRNA的表達(dá)情況。
　　采用克隆細(xì)胞球計(jì)數(shù)法、MTT法

7、、免疫細(xì)胞化學(xué)染色等方法檢測(cè)外源性EPO對(duì)低氧狀態(tài)下NSCs增殖、分化的作用。
　　結(jié)果： Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示:對(duì)照組EPO蛋白表達(dá)較低，而低氧組在3~48 h內(nèi)都有表達(dá)，以12 h表達(dá)量最高。NSCs分化的細(xì)胞在低氧3 h時(shí)，EPO在mRNA水平表達(dá)量比對(duì)照組明顯增加，24 h時(shí)表達(dá)量最高。施加外源性 EPO后，NSCs的克隆形成率與對(duì)照組比較p<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；EPO組細(xì)胞OD值比對(duì)照組明顯增高。EP