IGFBP-2介導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化的研究.pdf

1、目的:
　　探討胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-2（insulin-like growth factorbinding protein-2，IGFBP-2）在神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)增殖和分化中的作用及機(jī)制。
　　方法:
　　1.嗅鞘細(xì)胞條件培養(yǎng)基(olfactory ensheathing cells-conditionedmedium，OCM)和星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基(astrocyte

2、s-conditionedmedium，ACM)中IGFBP-2表達(dá)情況分析:取新生1d昆明小鼠，分離培養(yǎng)嗅鞘細(xì)胞（olfactory ensheathing cells，OECs）和星形膠質(zhì)細(xì)胞(Astrocytes，ACs)，分別制備無血清OCM和ACM。凝膠電泳、蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析及Western Blot檢測(cè)OCM和ACM中IGFBP-2的含量，ELISA法測(cè)定IGFBP-2濃度。
　　2.IGFBP-2對(duì)NSCs增殖的影響:

3、取第3代C17.2，根據(jù)IGFBP-2終濃度的不同分為0 ng/ml組、125 ng/ml組、250 ng/ml組、500 ng/ml組。作用5d后倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況并計(jì)數(shù)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化并計(jì)算增殖指數(shù)，MTT檢測(cè)細(xì)胞生長曲線。收集各組細(xì)胞行Western Blot檢測(cè)細(xì)胞核增殖相關(guān)抗原(Ki67、PCNA)表達(dá)情況，檢測(cè)總蛋白激酶1/2(total extracellular regulated proteink

4、inases，t-ERK1/2)及活化蛋白激酶1/2(positive extracellular regulated protein kinases，p-ERK1/2)表達(dá)情況;
　　3.IGFBP-2誘導(dǎo)NSCs分化:取第3代C17.2，根據(jù)培養(yǎng)基的不同，分為DMEM/F12培養(yǎng)基組和OCM培養(yǎng)基組，并根據(jù)IGFBP-2終濃度的不同分為0 ng/ml組，125 ng/ml組、250 ng/ml組、500 ng/ml組，誘導(dǎo)5d

5、后收集各組細(xì)胞，行Western Blot檢測(cè)細(xì)胞巢蛋白(Nestin)、神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(GFAP)及β-微管蛋白Ⅲ（TUJ-1）表達(dá)情況，免疫熒光染色法鑒定GFAP，TUJ-1陽性細(xì)胞并計(jì)數(shù)，流式分析GFAP，TUJ-1陽性細(xì)胞。
　　結(jié)果:
　　1.OCM和ACM中IGFBP-2表達(dá)情況分析: Western Blot顯不OCM中IGFBP-2蛋白表達(dá)比ACM中高。電泳及質(zhì)譜分析結(jié)果示OCM中IGFBP-2的表達(dá)量約為

6、ACM的2.3倍，ELISA檢測(cè)結(jié)果顯不OCM中IGFBP-2濃度為188±48.84 ng/ml，ACM中濃度為49.25±21.14 ng/ml;
　　2.IGFBP-2對(duì)NSCs增殖的影響:隨著IGFBP-2濃度的遞增，C17.2細(xì)胞數(shù)目及細(xì)胞活力明顯增加，細(xì)胞周期檢測(cè)示0 ng/ml組、125 ng/ml組、250 ng/ml組、500 ng/ml組S期細(xì)胞占比分別為(％):7.03±0.59、8.76±0.86、11.1

7、5±0.56、13.10±0.88，各組增殖指數(shù)PI分別為(％):17.62±2.12、19.98±2.04、21.71±1.76、25.48±1.01。Western Blot結(jié)果也證實(shí)，隨著IGFBP-2濃度的增加，PCNA，Ki-67的表達(dá)隨之提高;并且發(fā)現(xiàn)C17.2經(jīng)IGFBP-2誘導(dǎo)5 min后，t-ERK1/2的表達(dá)無明顯改變，p-ERK1/2表達(dá)迅速增加。
　　3.IGFBP-2誘導(dǎo)NSCs分化:D/F12培養(yǎng)基組:

8、Western Blot、流式分析示各濃度組GFAP、TUJ-1表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;OCM培養(yǎng)基組:免疫熒光計(jì)數(shù)示0 ng/ml組、125 ng/ml組、250 ng/ml組、500 ng/ml組GFAP陽性細(xì)胞數(shù)目分別為(％):6.87±1.34、5.24±6.04、28.14±6.38、2.97±10.03;各組TUJ-1陽性細(xì)胞數(shù)目分別為(％):44.00±6.48、25.24±5.85、20.25±7.59、11.50±4.1

9、3。Western Blot也證實(shí)，隨IGFBP-2濃度升高，GFAP表達(dá)逐漸增多，TUJ-1表達(dá)逐漸減少，各濃度組與對(duì)照組及各濃度組組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1.IGFBP-2具有促進(jìn)C17.2增殖的作用，此作用與IGFBP-2濃度呈正相關(guān)，其機(jī)制可能與ERK1/2通路激活有關(guān);
　　2.IGFBP-2對(duì)C17.2分化無影響;
　　3.在OCM誘導(dǎo)條件下，IGFBP-2具有促進(jìn)C17.2向膠質(zhì)細(xì)