β-catenin轉(zhuǎn)染表皮干細(xì)胞對糖尿病大鼠創(chuàng)面修復(fù)的影響.pdf

1、目的:
　　探討體外培養(yǎng)條件下不同葡萄糖濃度對大鼠表皮干細(xì)胞( epidermal stem cells,ESCs)生長的影響,以及上調(diào)β-catenin的表達(dá)對糖尿病(Diabetes Mellitus, DM)大鼠表皮干細(xì)胞增殖分化的作用,觀察上調(diào)糖尿病大鼠表皮干細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)對創(chuàng)面愈合的影響,為臨床糖尿病創(chuàng)面的修復(fù)治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:
　　(1)取SD大鼠背部皮膚,采用酶消化法分離表皮和

2、真皮,Ⅳ型膠原差速貼壁法純化表皮干細(xì)胞,建立體外培養(yǎng)大鼠表皮干細(xì)胞模型,隨機(jī)分成A組(對照組,葡萄糖濃度5.5mmol/L),B組(葡萄糖濃度10mmol/L),C組(葡萄糖濃度20mmol/L),D組(葡萄糖濃度40mmol/L)。顯微鏡下觀察表皮干細(xì)胞的生長情況,免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測表皮干細(xì)胞中β-catenin、Wnt1的表達(dá),使用圖像分析軟件測量陽性細(xì)胞表達(dá)的平均積分光密度值。
　　(2)制備糖尿病大鼠模型(腹腔一次性注射鏈

3、脲佐菌素STZ,劑量為65mg/kg),體外分離培養(yǎng)糖尿病大鼠表皮干細(xì)胞(ESCs),采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將pcDNA3.1myc-β-catenin質(zhì)粒轉(zhuǎn)入ESCs,同時設(shè)立脂質(zhì)體對照組(轉(zhuǎn)脂質(zhì)體)和正常對照組,48h后,免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測各組表皮干細(xì)胞中β-catenin的表達(dá);Western Blot檢測轉(zhuǎn)染組與正常對照組表皮干細(xì)胞中β-catenin、Wnt1、CyclinD1的表達(dá)情況。
　　(3)選取成模的DM大鼠15只,

4、分別在脊柱兩側(cè)的背部制備直徑約2.0cm的全層皮膚缺損創(chuàng)面,即每只大鼠制備四個創(chuàng)面,并隨機(jī)分為4組:A組(創(chuàng)面移植羊膜負(fù)載轉(zhuǎn)染的表皮干細(xì)胞組),B組(創(chuàng)面移植羊膜負(fù)載未轉(zhuǎn)染表皮干細(xì)胞組), C組(羊膜組)和D組(空白對照組,不加任何干預(yù))。觀察創(chuàng)面愈合情況并測算創(chuàng)面愈合率,采用HE染色進(jìn)行組織病理學(xué)觀察以及免疫組織化學(xué)法檢測創(chuàng)面組織中增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　(1)顯微鏡下觀察,隨著葡萄糖濃度的升高

5、,細(xì)胞數(shù)量逐漸減少,生長速度緩慢,胞體透亮度下降,活力降低;免疫細(xì)胞化學(xué)染色分析結(jié)果顯示,C組β-catenin(0.079±0.007)、Wnt1(0.083±0.004)和D組β-catenin(0.068±0.008)、Wnt1(0.070±0.006)的表達(dá)均明顯低于A組(β-catenin:0.096±0.123;Wnt1:0.095±0.010),p<0.01。
　　(2)免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示,表皮干細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后

6、β-catenin的表達(dá)增高,其表達(dá)水平高于脂質(zhì)體組和空白對照組(p<0.01),脂質(zhì)體組和空白對照組組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。Western Blot檢測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染組β-catenin、Wnt1、CyclinD1的表達(dá)均高于空白對照組(1.451±0.027vs1.094±0.026;1.084±0.078vs0.694±0.082;1.490±0.030vs0.807±0.019,p<0.01)。
　　(3)A

7、組創(chuàng)面與B、C、D組相比較,其愈合時間縮短且創(chuàng)面愈合率提高,組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),各組創(chuàng)面組織中均可見PCNA陽性細(xì)胞表達(dá),A組的陽性細(xì)胞表達(dá)高于其他三組。
　　結(jié)論:
　　(1)本實(shí)驗(yàn)條件下高濃度葡萄糖對體外培養(yǎng)大鼠表皮干細(xì)胞的生長有抑制作用,且表皮干細(xì)胞中β-catenin、Wnt1的表達(dá)減弱。
　　(2)采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法可成功將pcDNA3.1myc-β-catenin重組真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入體外