大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療糖尿病大鼠的研究.pdf

1、目的：通過大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)，選擇一種簡便、有效的分離、純化方法；通過檢測移植治療后雌性糖尿病大鼠血糖、C-肽的變化，及胰腺冰凍切片細(xì)胞DAPI標(biāo)記，胰腺石蠟切片原位雜交顯示Y染色體標(biāo)記情況，進(jìn)一步揭示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為胰島樣細(xì)胞的機(jī)制；通過比較骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在腹腔注射、尾靜脈注射、腎包囊注射幾種不同移植部位，尋找一種最佳的移植部位，為糖尿病的細(xì)胞治療提供新的思路和方法。 方法：1以密度梯度離心法結(jié)合貼壁細(xì)胞

2、分離法分離純化雄性大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，傳代擴(kuò)增，相差顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察，待骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)至3代或3代后，給于細(xì)胞DAPI標(biāo)記，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核染色情況。 2將雌性糖尿病大鼠隨機(jī)分為4組(各組10只)：①對照組，腹腔注射PBS0.2ml，②腹腔注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組，腹腔注射經(jīng)DAPI標(biāo)記后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞0.2ml，③尾靜脈注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組，尾靜脈注射經(jīng)DAPI標(biāo)記后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞0.2ml，④腎包囊注

3、射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組，右側(cè)腎包囊下注射經(jīng)DAPI標(biāo)記后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞0.2ml。 3采用血糖儀分別于各組在注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞或PBS前及注射后第3、5、7天采集尾靜脈血檢測血糖，采用放射免疫法分別各組于注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞或PBS前割尾收集血、及注射后7天心臟取血檢測C-肽水平。 4治療后1周處死各組大鼠取胰腺組織作冰凍切片、石蠟切片，倒置熒光顯微鏡下觀察胰腺冰凍切片中的DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核染色情況，原位雜交技術(shù)檢測

4、雌性大鼠組織胰腺石蠟切片中的含有Y染色體的細(xì)胞。 5統(tǒng)計(jì)學(xué)采用單因素方差分析、t檢驗(yàn)，顯著差異性為P＜0.05。 結(jié)果：1用密度1.073g/ml的percoll分離液分離骨髓懸液，將得到的球形單個(gè)核細(xì)胞接種于25cm2塑料培養(yǎng)瓶中，24小時(shí)后部分細(xì)胞貼壁生長，至培養(yǎng)第3代通過全量換液逐漸去除殘留的各種血細(xì)胞，貼壁生長的細(xì)胞成單個(gè)分散存在或形成數(shù)個(gè)細(xì)胞克隆，呈梭形。原代培養(yǎng)7-10天細(xì)胞生長達(dá)80％融合，用0.25％胰酶

5、-0.03％EDTA消化，按1：3傳代，傳代后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)與原代相似，生長4-5天達(dá)融合，繼續(xù)傳代擴(kuò)增。待骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)至3代或3代后，給于細(xì)胞DAPI標(biāo)記，倒置熒光顯微鏡下可見蘭色熒光，與平片重疊后可見蘭色熒光位置位于細(xì)胞核。 2血糖結(jié)果顯示，對照組、腹腔注射組治療后第3天、5天、7天血糖值較治療前顯示無明顯下降(P＞0.05)；尾靜脈注射組、腎包囊注射組治療后第3天、5天、7天血糖值較治療前顯示有明顯下降(P

6、＜0.01)。與對照組相對應(yīng)時(shí)間比較，腹腔注射組治療后血糖無明顯下降；尾靜脈注射組第7天血糖下降(P＜0.05)，尾靜脈注射組第3天、5天、腎包囊注射組第3天、5天、7天血糖下降明顯(P＜0.01)。 3C-肽值結(jié)果顯示，對照組、腹腔注射組治療后與治療前相比C-肽值無上升(P＞0.05)；尾靜脈注射組、腎包囊注射組治療后與治療前相比C-肽值有所上升(p＜0.01)。與對照組相對應(yīng)時(shí)間比較，腹腔注射組治療后C-肽值無明顯改變(P＞

7、0.05)；尾靜脈注射組、腎包囊注射組治療后C-肽值明顯升高(p＜0.01)。 4對照組、腹腔注射組、尾靜脈注射組胰腺組織冰凍切片倒置熒光顯微鏡下均未見蘭色熒光存在，腎包囊注射組胰腺組織冰凍切片中熒光顯微鏡下可見蘭色熒光存在，提示該組織切片中具有來源于骨髓的DAPI標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞。 5倒置熒光顯微鏡下觀察對照組、腹腔注射組胰腺組織石蠟切片中均未見黃綠熒光存在，尾靜脈組及腎包囊組中倒置熒光顯微鏡下胰腺組織中均可

8、見黃綠熒光存在，存在于胰腺腺泡間隙，提示來源于雄性大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞在尾靜脈注射及腎包囊注射的途徑下可到達(dá)雌性糖尿病大鼠胰腺組織。 結(jié)論：1采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁細(xì)胞分離法分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，可得到數(shù)量較多、純度較高的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。 2雄性大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在尾靜脈、腎包囊注射下可到達(dá)雌性糖尿病大鼠胰腺組織，使糖尿病大鼠血糖下降，C-肽水平有所恢復(fù)，分化為胰島素分泌細(xì)胞的可能性。 3同種異體骨