骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靜脈移植對(duì)腦梗死大鼠治療作用的研究.pdf

1、目的：大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMSCs）體外分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增；β-巰基乙醇體外誘導(dǎo)其向神經(jīng)組織分化，電鏡及免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定分化細(xì)胞方向；Longa改良線栓法建立大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞（Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAO）模型，觀察第4代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靜脈移植對(duì)成模大鼠的治療效果；明確骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是否可經(jīng)血液循環(huán)歸巢至受損

2、腦區(qū)；是否可在腦內(nèi)存活、遷移、并向神經(jīng)組織分化；是否促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)因子（Nerve growth factor，NGF）、腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子（Brain-drived neurotrophic factor，BDNF）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）的分泌；是否減少腦缺血半暗帶區(qū)細(xì)胞凋亡。以此探討B(tài)MSCs的生物學(xué)特性及靜脈移植治療大鼠腦梗死的效果和機(jī)制。
　　

3、 方法：
　　 1.取3～4周齡的健康雄性SD大鼠，采用percoll密度梯度離心法結(jié)合貼壁法分離培養(yǎng)BMSCs，傳代擴(kuò)增，取第4代細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，倒置相差顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。
　　 2.按照Woodbury方案進(jìn)行預(yù)誘導(dǎo)和誘導(dǎo)。L-DMEM培養(yǎng)基+1mmol/L，β-巰基乙醇+20％FBS預(yù)誘導(dǎo)24小時(shí)后，L-DMEM+5mmol/L，β-巰基乙醇誘導(dǎo)5小時(shí)，之后去除誘導(dǎo)液為常規(guī)培養(yǎng)基，再培養(yǎng)2周。
　　

4、 3.誘導(dǎo)后進(jìn)行細(xì)胞鑒定：倒置相差顯微鏡下觀測(cè)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變；免疫細(xì)胞化學(xué)染色法對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)前體細(xì)胞表面標(biāo)志（神經(jīng)上皮巢蛋白nestin）、神經(jīng)元細(xì)胞表面標(biāo)志（神經(jīng)元特異性烯醇化酶neuron specific enolase，NSE）、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志（膠質(zhì)纖維酸性蛋白glial fibrillary acidic protein，GFAP）的鑒定。
　　 4.第3代BMSCs傳代、

5、換液后進(jìn)行Brdu標(biāo)記，時(shí)間大約3天，待第4代細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底時(shí)收集細(xì)胞，待移植。
　　 5.健康雄性成年SD大鼠（3月齡，體重270-300g），Longa改良線栓法制作大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞（Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAO）模型。取成模大鼠50只隨機(jī)分成兩組，BMSCs移植組和PBS對(duì)照組，每組25只。
　　 6.于MCAO 24h后，將Brdu標(biāo)記的第4代BMSCs細(xì)胞1mL

6、（含3x106個(gè)細(xì)胞）從尾靜脈植入BMSCs組大鼠，對(duì)照組同樣途徑給予等量PBS。于MCAO后1天（移植前）、移植后7、14、21天各組大鼠分別進(jìn)行改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分（modifled Neurological Severity Scores，mNSS）；移植術(shù)后7天，各組大鼠分別隨機(jī)取5只進(jìn)行TTC染色測(cè)定梗死體積；再于同一天和第14、21、28天兩組各處死大鼠5只，灌注取腦，多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制作石

7、蠟切片。分別行HE染色觀察腦缺血病理改變；TUNEL染色觀察細(xì)胞凋亡；免疫組織化學(xué)染色鑒定移植入腦的BMSCs及分化以及NGF、BDNF、VEGF等因子的分泌。
　　 7.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)建立EXCEL數(shù)據(jù)庫，資料采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。兩組間同一時(shí)間點(diǎn)樣本均數(shù)采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，同一組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)組間均數(shù)之間采用單因素方差分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±S）表示，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

8、義。
　　 結(jié)果：
　　 1.BMSCs接種初期細(xì)胞呈圓形懸浮狀態(tài)，24小時(shí)后大部分細(xì)胞貼壁。貼壁細(xì)胞單個(gè)分散存在或形成數(shù)個(gè)細(xì)胞克隆，逐漸伸角變形，呈圓形、多角形、長(zhǎng)梭形等多種形態(tài)。傳代后，細(xì)胞形態(tài)逐漸純化，至第4代，形態(tài)單一，呈長(zhǎng)梭形，漩渦狀和平行排列生長(zhǎng)。
　　 2.預(yù)誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，加入誘導(dǎo)液后細(xì)胞形態(tài)迅速改變，誘導(dǎo)5小時(shí)部分細(xì)胞漂浮、崩解、死亡，細(xì)胞形態(tài)不再發(fā)生明顯改變，大部分細(xì)胞呈現(xiàn)神經(jīng)元樣形

9、態(tài)。之后用常規(guī)培養(yǎng)基替換誘導(dǎo)液，一周以后，大多數(shù)細(xì)胞仍為神經(jīng)元樣形態(tài)，第2周細(xì)胞形態(tài)緩慢改變，2周時(shí)，細(xì)胞形態(tài)逐漸回到誘導(dǎo)前扁平的梭形狀態(tài)。
　　 3.誘導(dǎo)后細(xì)胞神經(jīng)標(biāo)志物的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)顯示：空白對(duì)照組Nestin、NSE、GFAP均無表達(dá)。其余組GFAP均為陰性。預(yù)誘導(dǎo)組Nestin陽性細(xì)胞表達(dá)，Nestin陽性細(xì)胞數(shù)在誘導(dǎo)1h后達(dá)到高峰，約為29.35％，誘導(dǎo)5h時(shí)幾乎測(cè)不到。NSE陽性細(xì)胞率隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸提高，誘導(dǎo)

10、5h時(shí)NSE的陽性率約為57.53％。Nestin、NSE兩個(gè)指標(biāo)預(yù)誘導(dǎo)24h，誘導(dǎo)1h，誘導(dǎo)5h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)陽性細(xì)胞率比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。撤出誘導(dǎo)液常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)到誘導(dǎo)前時(shí)，此時(shí)檢測(cè)Nestin、NSE、GFAP均為陰性。
　　 4.透射電鏡結(jié)果：未誘導(dǎo)的BMSCs，胞核呈不規(guī)則形，胞漿較少，核質(zhì)比大，細(xì)胞器不發(fā)達(dá)，偶爾可見處于分裂過程的細(xì)胞，表現(xiàn)出早期幼稚細(xì)胞特點(diǎn)。與誘導(dǎo)前相比，誘導(dǎo)后細(xì)胞胞核大而圓，核仁

11、明顯，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器更多，細(xì)胞核旁有豐富的高爾基復(fù)合體，可見大量擴(kuò)張成圓形的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和部分扁平（靜止?fàn)顟B(tài)）的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，可見圓形、橢圓形線粒體，少量游離核糖體。
　　 5.大鼠右側(cè)MCAO后，出現(xiàn)行走向右側(cè)轉(zhuǎn)圈或向右側(cè)跌倒。術(shù)后1天TTC染色：梗死灶成白色，位于右側(cè)額頂顳區(qū)皮層、基底節(jié)區(qū)；術(shù)后1天HE染色：右側(cè)額顳頂葉皮層和基底節(jié)區(qū)大量神經(jīng)細(xì)胞消失，可見固縮、碎裂、變形的胞核，濃染的胞漿，間質(zhì)水腫明顯。以上均提示形成大腦中動(dòng)脈

12、供血范圍梗死。
　　 6.兩組大鼠在術(shù)后24h神經(jīng)功能缺損評(píng)分（mNSS）明顯升高，兩組無差異（P>0.05）。各組評(píng)分隨時(shí)間呈逐步下降趨勢(shì)，自移植后第7天開始的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)， BMSCs組大鼠的神經(jīng)缺損評(píng)分比同時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組有明顯的降低，且差異顯著（7d，p<0.05；14d、21d，p<0.01）。
　　 7.移植后7d，TTC染色提示BMSCs移植組與對(duì)照組相比梗死體積縮小，且差異顯著（梗死體積：BMSCs組為21.

13、21％土1.58％，對(duì)照組為25.75％土2.08％（P<0.05）。
　　 8.HE染色顯示：兩組均可見壞死中心神經(jīng)元大量缺失，膠質(zhì)細(xì)胞增生，微血管增生，BMSCs組和對(duì)照組比較，膠質(zhì)細(xì)胞增生較少，微血管增生明顯。
　　 9.TUNEL染色顯示：兩組在缺血邊緣區(qū)均可見核染成棕色的凋亡細(xì)胞，BMSCs組凋亡細(xì)胞較對(duì)照組明顯減少，BMSCs組24.64±3.2/HP；對(duì)照組64.2±4.1/HP（P=1.53403E-07

14、<0.01）。
　　 10.BMSCs組大鼠在移植后4個(gè)時(shí)間點(diǎn)均檢測(cè)到Brdu標(biāo)記陽性細(xì)胞，DAB染色核顯棕黃色，主要位于半球缺血區(qū)及缺血邊緣區(qū)，陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)第7天43.6±2.7/HP，第14天35.8±2.59/HP，第21天18.4±2.4HP，第28天11.44±1.14/HP，隨時(shí)間延長(zhǎng)呈逐漸下降趨勢(shì)（P<0.01）。第21天腦片檢測(cè)到Brdu/GFAP雙標(biāo)陽性細(xì)胞（未計(jì)數(shù)），Brdu/NSE雙標(biāo)陽性結(jié)果不理想。BMS

15、Cs組缺血邊緣區(qū)GFAP陽性細(xì)胞數(shù)少于對(duì)照組（未計(jì)數(shù)）。
　　 11.兩組第7天腦片，BDNF、NGF、VEGF免疫組化染色：陽性結(jié)果為胞漿顯棕黃色。BDNF表達(dá)，BMSCs組：平均光密度值=IOD/area=0.47±0.05，對(duì)照組：平均光密度值=IOD/area=0.3 1±O.03；NGF表達(dá)，BMSCs組：平均光密度值=IOD/area=0.49±0.10，對(duì)照組：平均光密度值=IOD/area=0.28±0.11；V

16、EGF表達(dá)，BMSCs組：平均光密度值=IOD/area=0.28±0.03，對(duì)照組：平均光密度值=IOD/area=0.13±0.05。BMSCs組BDNF、NGF、VEGF陽性細(xì)胞累積平均光密度值較對(duì)照組明顯增高，兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)P值分別為O.000596、0.001877、1.92151E-05，均小于0.01。
　　 結(jié)論：
　　 1.Percoll密度梯度離心及貼壁法聯(lián)合應(yīng)用，可獲得良好純化的BMSCs。

17、>　　 2.BMSCs經(jīng)β-巰基乙醇誘導(dǎo)后，形態(tài)向神經(jīng)元樣細(xì)胞轉(zhuǎn)變，GFAP表達(dá)陰性， Nestin表達(dá)在NSE之前，說明β-巰基乙醇體外誘導(dǎo)BMSCs可分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，不能分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；BMScs首先分化為神經(jīng)干（前體）細(xì)胞，再轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。同時(shí)這種化學(xué)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)分化過程迅速、可逆，不能穩(wěn)定持久，且損傷細(xì)胞。故分化后的BMSCs不宜用作干細(xì)胞療法的種子細(xì)胞。
　　 3.Longa改良線栓法可得到大鼠穩(wěn)定MCA

18、O模型，該模型易于復(fù)制，梗死部位位于大腦中動(dòng)脈供血區(qū)，位置較恒定，是研究缺血性卒中理想的動(dòng)物模型。
　　 4.腦缺血大鼠靜脈移植BMSCs后，顯著改善了受損的神經(jīng)功能。植入的細(xì)胞大多歸巢至缺血灶及其邊緣，少數(shù)細(xì)胞存活（至少1月）、分化并可能部分替代受損細(xì)胞；通過增加神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子NGF、BDNF的表達(dá)，從而影響缺血區(qū)微環(huán)境，減少缺血半暗帶區(qū)細(xì)胞凋亡起到神經(jīng)保護(hù)作用；增加血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF的分泌促進(jìn)血管生成；降低缺血灶邊緣疤痕