人羊膜間充質(zhì)干細胞原位移植治療大鼠腦梗死

1、中國組織工程研究第21卷第9期2017–03–28出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchMarch282017Vol.21No.9P.O.Box10002Shenyang110180www.CRTER.g1414研究原著www.CRTER.g王鈺瑩，女，1981年生，湖北省通城縣人，漢族，2010年遵義醫(yī)學院畢業(yè)，碩士，副教授，主要從事成體干細胞應用基礎研究。通訊作者：王鈺瑩，遵義醫(yī)學院附

2、屬醫(yī)院，貴州省細胞工程重點實驗室，貴州省遵義市563000中圖分類號:R394.2文獻標識碼:B文章編號:20954344(2017)090141406稿件接受：20161020WangYuyingMasterAssociateprofessKeyLabatyofCellEngineeringofGuizhouProvinceAffiliatedHospitalofZunyiMedicalUniversityZunyi563000Gui

3、zhouProvinceChinaCrespondingauth:WangYuyingKeyLabatyofCellEngineeringofGuizhouProvinceAffiliatedHospitalofZunyiMedicalUniversityZunyi563000GuizhouProvinceChina人羊膜間充質(zhì)干細胞原位移植治療大鼠腦梗死王鈺瑩1，粟旭2，劉波3，劉娟4，萬雪1(1遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院，貴州省細胞工程重點

4、實驗室，貴州省遵義市563000；2遵義醫(yī)學院藥學院，貴州省遵義市563000；3遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學研究所，貴州省遵義市563000；4遵義醫(yī)學院教育部基礎藥理學重點實驗室，貴州省遵義市563000)引用本文：王鈺瑩，粟旭，劉波，劉娟，萬雪.人羊膜間充質(zhì)干細胞原位移植治療大鼠腦梗死[J].中國組織工程研究，2017，21(9):14141419.DOI:10.3969j.issn.20954344.2017.09.019CID:

5、0000000223999094(王鈺瑩)文章快速閱讀：文題釋義：人羊膜間充質(zhì)干細胞：具有干細胞特性，表達胚胎干細胞和間充質(zhì)干細胞的標志，在不同生長因子的調(diào)節(jié)下，可分化成3個胚層來源的不同組織細胞類型。人羊膜間充質(zhì)干細胞具有向神經(jīng)細胞分化的能力，其在特定條件下誘導后，能表達NSE、GFAP、NF、βtubulinⅢ、MAP2及NeuN。人羊膜間充質(zhì)干細胞移植治療腦梗死：已有研究發(fā)現(xiàn)，移植人羊膜間充質(zhì)干細胞治療肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥小鼠，

6、可延長其生存，改善其運動功能。Li等發(fā)現(xiàn)移植人羊膜間充質(zhì)干細胞2周后，在缺血性區(qū)域可見存活的細胞，且移植8周后神經(jīng)功能明顯改善。Palmatir等發(fā)現(xiàn)人、猴和鼠的羊膜組織中存在可溶性的促進神經(jīng)細胞生長的物質(zhì)，能促進培養(yǎng)的脊髓后跟神經(jīng)節(jié)細胞生長。摘要背景：前期實驗研究發(fā)現(xiàn)，移植人羊膜間充質(zhì)干細胞能有效改善腦梗死大鼠的神經(jīng)損傷癥狀。目的：觀察移植人羊膜間充質(zhì)干細胞在大鼠腦梗死區(qū)域的存活、定植和分化情況。方法：將60只SD大鼠隨機分為3組，實

7、驗組、模型組采用線栓法制作大腦中動脈閉塞模型，假手術(shù)組只結(jié)扎血管，不插入線栓；造模后1d，實驗組于受損紋狀體和皮質(zhì)兩點原位植入10μL第3代人羊膜間充質(zhì)干細胞懸液(含細胞2106只)，模型組與假手術(shù)組于相同部位注射等體積PBS。移植后1周連續(xù)監(jiān)測體質(zhì)量并進行神經(jīng)缺損嚴重程度評分；移植后2周，TTC染色觀察腦梗死面積，蘇木精伊紅染色觀察腦組織病理學變化，免疫熒光染色檢測移植大鼠大腦神經(jīng)細胞標志物神經(jīng)元特異性核蛋白的表達。結(jié)果與結(jié)論：①體質(zhì)

8、量與神經(jīng)缺損嚴重程度評分：與假手術(shù)組比較，模型組、實驗組體質(zhì)量呈下降趨勢，實驗組降低少于模型組，但差異無顯著性意義；模型組、實驗組神經(jīng)功能缺損評分隨時間呈逐漸降低趨勢，但實驗組評分明顯低于模型組；②腦梗死面積：模型組大腦皮質(zhì)出現(xiàn)局灶性缺血壞死且范圍較大，與模型組比較，實驗組缺血灶面積明顯縮??；③腦組織病理：實驗組梗死病灶范圍、神經(jīng)細胞及炎細胞浸潤均少于模型組；④免疫熒光染色：移植后1周，實驗組腦組織可見較多的移植人羊膜間充質(zhì)干細胞，2周

9、后可見移植的人羊膜間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)樣細胞分化；⑤結(jié)果表明：人羊膜間充質(zhì)干細胞移植可在大鼠腦梗死區(qū)域定植、存活，且在原位能分化為神經(jīng)樣細胞。關鍵詞：干細胞；移植；人羊膜間充質(zhì)干細胞；腦梗死主題詞：干細胞；干細胞移植；梗塞，大腦中動脈；組織工程基金資助：貴州省科學技術(shù)基金項目資助(黔教研合J字LKZ[2011]24號)縮略語：人羊膜間充質(zhì)干細胞：humanamnioticmesenchymalstemcells，hAMSCsthotopi

10、ctransplantationofhumanamnioticmesenchymalstemcellsftreatmentofcerebralinfarctioninratsWangYuying1SuXu2LiuBo3LiuJuan4WanXue1(1KeyLabatyofCellEngineeringofGuizhouProvince人羊膜間充質(zhì)干細胞原位移植修復腦梗死SD大鼠實驗組制作大腦中動脈閉塞模型后移植人羊膜間充質(zhì)干細胞模型組

11、制作大腦中動脈閉塞模型后移植PBS假手術(shù)組假手術(shù)組只結(jié)扎血管，不插入線栓移植后1周連續(xù)監(jiān)測體質(zhì)量并進行神經(jīng)缺損嚴重程度評分；移植后2周，進行TTC染色、蘇木精伊紅染色與免疫熒光染色結(jié)果表明：人羊膜間充質(zhì)干細胞移植可在大鼠腦梗死區(qū)域定植、存活，且在原位能分化為神經(jīng)樣細胞王鈺瑩，等.人羊膜間充質(zhì)干細胞原位移植治療大鼠腦梗死P.O.Box10002Shenyang110180www.CRTER.g1416www.CRTER.g1.4實驗方法h

12、AMSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定及標記[11]：經(jīng)產(chǎn)婦知情同意后，采自足月剖宮產(chǎn)分娩胎盤，剝離羊膜，二酶消化法分離提取hAMSCs，懸浮于含體積分數(shù)10%FBS的LDMEM培養(yǎng)基中，按5105cm2的細胞密度接種傳代培養(yǎng)。當原代培養(yǎng)細胞生長達80%匯合時，用胰蛋白酶消化收集細胞，調(diào)整細胞濃度至1109L1。取第3代細胞懸液200μL，按組合方案加10μL相應的熒光標記單抗(CD44FITC、CD29PE、CD73PE、CD45FITC、CD

13、34PE、HLADR)混勻，用10gL多聚甲醛固定后進行FCM檢測分析，小鼠IgGFITC或IgGPE作為同型對照；并以鼠抗人細胞系特異性抗體MAB1281作為一抗，標記干細胞。大鼠大腦中動脈閉塞模型的建立及hAMSCs細胞移植：模型組、實驗組采用大腦中動脈閉塞和再灌注的方法制備大鼠腦梗死模型[12]，7%水合氯醛(5mLkg)腹腔麻醉，分離右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈及頸外動脈，結(jié)扎頸外動脈，插入標記好的栓線，深度1820mm，阻斷大腦中動

14、脈血流來源。2h后抽出栓線，實現(xiàn)大腦中動脈血流再通；假手術(shù)組只結(jié)扎血管，不插入線栓。以大鼠清醒后出現(xiàn)左側(cè)前肢倦曲、行走轉(zhuǎn)圈或則行走向左側(cè)倒等體征納入模型制備成功。造模后1d，用腦立體定位儀選擇受損紋狀體和皮質(zhì)兩點原位植入10μLPBS懸浮的MAB1281標記第3代hAMSCs(含細胞2106只)，模型組和假手術(shù)組分別經(jīng)相同途徑注射等體積PBS。1.5主要觀察指標體質(zhì)量監(jiān)測及神經(jīng)功能缺損評分：造模前、造模后1d(移植前)、移植后17d連續(xù)

15、9d監(jiān)測神經(jīng)功能缺損評分，每次評分前稱大鼠體質(zhì)量，檢測體質(zhì)量變化。參照Bedersons評分進行神經(jīng)功能缺損評分[13]：0分，無神經(jīng)功能損傷癥狀；1分，體尾懸空時，大鼠對側(cè)前肢表現(xiàn)為腕時屈曲，肩內(nèi)旋肘外展；2分，將大鼠置光滑平面上，推動手術(shù)側(cè)肩向?qū)?cè)移動，阻力降低；3分，大鼠自由行走時，向手術(shù)側(cè)倒或轉(zhuǎn)圈；4分，軟癱，肢體無自發(fā)活動。TTC染色觀察腦梗死面積：移植后第2周，用7%水合氯醛(5mLkg)腹腔注射，麻醉大鼠后迅速取出大腦，經(jīng)

16、速凍后用刀片將腦組織沿冠狀面均勻切成5片，每片約2mm。然后將腦片置于濃度為0.1%TTC溶液中，37℃避光振蕩孵育1530min，使其均勻接觸染色液。染色后，正常腦組織呈紅色，梗死組織呈蒼白色，根據(jù)蒼白區(qū)為確定梗死灶范圍。切片染色后拍照，觀察分析。組織形態(tài)學檢測：各組于移植后2周處死大鼠，做透心灌注及腦組織固定。7%水合氯醛(5mLkg)麻醉大鼠，暴露心臟，止血鉗夾閉腹主動脈，從心尖處進針，插入主動脈內(nèi)，剪開右心耳，灌注生理鹽水，之后

17、改為灌注40gL多聚甲醛，尸體僵硬后，斷頭，取出大腦放入40gL多聚甲醛固定，4℃過夜。次日取出大腦，冠狀面切取腦組織，石蠟包埋，蘇木精伊紅染色觀察腦組織病理結(jié)構(gòu)變化。免疫熒光染色檢測大鼠腦組織神經(jīng)元特異核蛋白的表達：移植后1，2周，OTC包埋行冰凍切片，加入抗人細胞核特異性抗體(MAB1281，1∶125)與神經(jīng)元特異核蛋白(NeuN，1∶50)的混合一抗，4℃孵育過夜，滴加異硫氰酸熒光素(FITC)標記的羊抗兔IgG(1∶100)與

18、PE標記的羊抗鼠IgG(1∶100)混合的二抗，孵育，滴加DAPI復染后緩沖甘油封固，熒光顯微鏡觀察拍照。1.6統(tǒng)計學分析采用SPSS13.0軟件分析，組間均數(shù)比較采用t檢驗，所有數(shù)據(jù)以s表示，對數(shù)據(jù)進行單因_x素方差，P0.05)，見表1。表1不同時間點腦梗死大鼠體質(zhì)量的變化情況(s，g)_xTable1Changesinratbodymassatdifferenttimeaftercerebralinfarction表注：與假手術(shù)組