骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞腦內(nèi)移植對錳中毒大鼠治療作用研究.pdf

1、目的：⑴探索最合適的錳中毒大鼠模型建立條件，并采用判別分析方法得到通用公式，篩選造模成功的大鼠為治療對象；⑵對造模成功的錳中毒大鼠進(jìn)行腦內(nèi)移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，觀察移植后細(xì)胞生長分化情況；⑶通過檢測多巴胺含量及路易小體相關(guān)成分的改變等觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療效果。
　　方法：①選用SPF級健康雄性SD大鼠24只，隨機(jī)分為對照組、低劑量組(15mg/kg)、中劑量組(25mg/kg)和高劑量組(50mg/kg)，腹腔注射MnCl2·

2、4H2O，每48h/次，每隔一個月對所有大鼠進(jìn)行行為學(xué)評分、肌張力改變、平衡木試驗(yàn)、水迷宮實(shí)驗(yàn)4項(xiàng)行為學(xué)測試，待大鼠出現(xiàn)明顯行為改變時停止染毒，并檢測其大腦紋狀體酪氨酸羥化酶(TyrosineHydroxylase，TH)含量，探索最合適的造模條件（染毒劑量和時間），并以對照組大鼠TH平均水平的30％為界劃分成錳中毒組和非錳中毒組，通過4項(xiàng)行為學(xué)指標(biāo)聯(lián)合建立判別分析函數(shù)，以便對下一步實(shí)驗(yàn)中的染毒大鼠進(jìn)行判斷。②按上述方法的最合適造模條件

3、對30只SD大鼠染錳，測試其行為學(xué)改變并記錄各項(xiàng)行為學(xué)評分、肌張力評分等，按照造模時得出的判別公式，對每一只染毒大鼠進(jìn)行判別。將所有符合錳中毒大鼠標(biāo)準(zhǔn)的大鼠挑選出來，隨機(jī)分成空白對照組、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow stromal cell，BMSCs)治療組和PBS對照組，對BMSCs治療組采用大腦立體定位法精準(zhǔn)注射BMSCs，PBS對照組注射PBS，空白對照組不做任何處理。一月后測試大鼠行為學(xué)改變，并檢測紋狀體內(nèi)多巴胺(

4、dopamine，DA)含量，免疫熒光觀察移植的干細(xì)胞生長、遷移和分化情況，western blot檢測路易小體主要成分α-syn和NF-L的含量，透射電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)改變。
　　結(jié)果：⑴造模條件探索結(jié)果:高劑量組大鼠死亡一只，采用行為學(xué)評分、肌張力評分、平衡木測試及水迷宮實(shí)驗(yàn)多項(xiàng)行為學(xué)評分來評估23只染錳大鼠的行為學(xué)改變，綜合測評大鼠的染毒效果。對照組大鼠三個月的各項(xiàng)行為學(xué)測試均為陰性，低劑量組行為學(xué)雖有改變但和對照組相比差異

5、有統(tǒng)計學(xué)意義的較少，高劑量組和中劑量組出現(xiàn)行為改變的時間更短并且在染毒三個月的時間點(diǎn)上各項(xiàng)行為學(xué)改變差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）。根據(jù)TH的表達(dá)，高劑量組造模成功率為100％，中劑量組成功率為66.67％。由于高劑量組實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)動物死亡情況，綜合評價得出采用25mg/kgBW濃度腹腔注射MnCl2·4H2O三個月為最佳造模條件。⑵判別分析結(jié)果:將對照組大鼠TH表達(dá)平均值作為正常水平，TH表達(dá)若低于正常水平的30％則為錳中毒模型

6、，由此將所有大鼠分為非錳中毒組和錳中毒。兩組大鼠各項(xiàng)行為學(xué)評分結(jié)果，錳中毒組大鼠行為學(xué)評分均高于非錳中毒組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。以行為學(xué)指標(biāo)全部作為自變量，以TH作為因變量納入判別方程。Fisher判別法得到函數(shù):錳中毒大鼠:Y=-31.830+8.867x1-4.995x2+9.862x3+0.952x4+8.877x5。非錳中毒大鼠:Y=-22.831+2.792x1-3.318x2+7.043x3+0.874x4+8

7、.241x5，其中x1-x5分別代表肌張力評分結(jié)果、平衡木評分結(jié)果、行為學(xué)評分結(jié)果、水迷宮逃避潛伏期、水迷宮平臺搜索次數(shù)。將大鼠的各指標(biāo)分別帶入上述兩組函數(shù)中求出判別函數(shù)值，哪個函數(shù)值更大，則該只大鼠即屬于哪個組。符合率為為95.7％(22/23)，誤判率為4.3％(1/23);該判別函數(shù)對非錳中毒大鼠和錳中毒大鼠的正確判別符合率分別是92.3％(12/13)和100％(10/10)。⑶骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后行為學(xué)改變和理化指標(biāo)觀察:3

8、0只染錳大鼠中經(jīng)過判別公式得出19只符合錳中毒標(biāo)準(zhǔn)，此次造模成功率為63.3％。移植手術(shù)后，大鼠生長情況良好，無感染或其他副反應(yīng)出現(xiàn)，一周左右大鼠的頭部皮膚完全愈合。治療前后三組大鼠行為學(xué)評分、肌張力評分、平衡木試驗(yàn)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。治療后三組大鼠紋狀體內(nèi)DA含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=5.376，P=0.016)，BMSCs治療組紋狀體DA含量高于對照組(P＜0.01)。免疫熒光可見兩組均有TH陽性細(xì)胞，但BMSCs治療組TH陽性明顯

9、比PBS對照組多，說明兩組都有DA神經(jīng)元存在且BMSCs治療組DA神經(jīng)元比PBS對照組多。BMSCs治療組可以看到聚集的H-Nuc表達(dá)，少數(shù)開始擴(kuò)散，并隨著腦脊液進(jìn)入各腦室，說明外源BMSCs在大鼠大腦中可以存活至少一月，并能夠遷移至其他區(qū)域。BMSCs治療組有TH與H-Nuc雙標(biāo)陽性細(xì)胞，PBS對照組無雙標(biāo)陽性細(xì)胞。說明人源BMSCs移植入SD大鼠大腦后可成功分化為DA能神經(jīng)元。PBS對照組同空白對照組差異不明顯。Western bl

10、ot顯示BMSCs移植治療后路易小體主要成分α-syn表達(dá)相比對照組減少而NF-L的含量增多。⑷骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后病理改變觀察:電鏡下，可以看到空白對照組的大鼠紋狀體內(nèi)較多神經(jīng)元周圍空泡、核周池擴(kuò)張，核固縮、染色質(zhì)聚集，膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)染色質(zhì)聚集現(xiàn)象。說明錳中毒大鼠紋狀體神經(jīng)元損傷和凋亡現(xiàn)象嚴(yán)重。神經(jīng)元內(nèi)還可見多處蛋白質(zhì)聚集且部分蛋白質(zhì)聚集物與溶酶體融合，髓鞘內(nèi)可見神經(jīng)絲異常。BMSCs治療組可見較多紋狀體神經(jīng)元核膜呈圓形或橢圓形，具有