EGF基因轉(zhuǎn)染人脂肪干細胞體外誘導表皮細胞修復創(chuàng)面的實驗研究.pdf

1、皮膚組織的缺損是整形和燒傷外科中常見的問題，多發(fā)生于燒傷、瘢痕或腫瘤切除后以及外傷性皮膚缺損、全身性疾患導致的皮膚慢性潰瘍等情況。對于較淺的燒傷創(chuàng)面或小面積的皮膚全層缺損，可以通過殘存皮膚附件的干細胞再生或臨近皮膚的上皮細胞遷移而愈合。對于較深的創(chuàng)面如Ⅲ度燒傷創(chuàng)面或大面積的皮膚全層缺損，需要采用自體皮膚或人工組織工程化皮膚進行修復。臨床常用的修復方法存在著許多缺點，如造成供區(qū)的損傷，大面積燒傷患者缺乏足夠的自體皮膚，而異體皮移植存在免疫

2、排斥反應。目前應用于臨床的皮膚組織工程產(chǎn)品仍存在一定的免疫排斥反應，治療效果欠佳。瘢痕的形成及嚴重程度和創(chuàng)面修復的時間關系密切，創(chuàng)面愈合時間越長，膠原沉積越多，導致形成的瘢痕越嚴重并影響局部的功能。因此如何能夠快速覆蓋并修復創(chuàng)面，在臨床上具有重要的研究價值和治療前景。 近年來干細胞的研究為解決這一難題提供了新的的思路和可能手段。干細胞分為胚胎干細胞和成體干細胞。它們在一定條件下，可以分化成各種類型細胞。由于胚胎干細胞的研究和應用

3、受到倫理學方面限制，因而成體干細胞的研究便受到人們的高度重視。不同來源的間充質(zhì)干細胞具有多分化潛能，體外或體內(nèi)可以分化為骨、軟骨、肌肉、脂肪、血管內(nèi)皮、肝臟、胰腺、神經(jīng)及上皮等多種組織細胞。 骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)可通過抽取自體骨髓分離得到，但對病人造成創(chuàng)傷較大。近年來研究發(fā)現(xiàn)脂肪組織中存在一群類似骨髓間充質(zhì)干細胞的成體干細胞。其多向誘導的能力和基因轉(zhuǎn)染的效率和MSCs沒有明顯的區(qū)別，而脂肪來源的干細胞(ADSCs)具有以

4、下優(yōu)勢：不需要大量的特殊血清擴增、供區(qū)損傷很少且可以分離大量的干細胞。目前沒有將ADSCs向表皮細胞分化的研究報道。本研究首先從人脂肪抽吸物中分離培養(yǎng)ADSCs，實現(xiàn)其體外長期傳代及大量擴增。并對其增殖情況、細胞周期及染色體情況進行分析。同時檢測了CD90、CD44、CD45、CD71、CD16、CD30、CD34、CD29、CD3、CD11b、CD133和CD19等表面分子的表達，其中CD90、CD29和CD71表達陽性。然后體外在誘

5、導培養(yǎng)基的條件下誘導ADSCs向表皮細胞分化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有少量細胞誘導后形態(tài)發(fā)生改變，呈鋪路石樣改變，角蛋白k19表達陽性，說明ADSCs在一定的誘導條件可以向表皮細胞分化。 表皮細胞生長因子(EGF)是由體內(nèi)多種細胞分泌的一種多肽類物質(zhì)，為有絲分裂刺激原，可以加快細胞分裂，促進增殖，還可以改變細胞的趨化性，增加細胞遷移。EGF在創(chuàng)面修復過程中發(fā)揮了重要作用。大量的動物及臨床實驗表明，EGF具有明顯促進創(chuàng)面愈合并提高皮膚修復質(zhì)量的

6、作用，其機制可能為：①促進創(chuàng)緣臨近組織上皮細胞的遷移、分化及增殖。②可以增加創(chuàng)面內(nèi)膠原和細胞內(nèi)DNA含量。③促進較淺創(chuàng)面殘存的表皮干細胞增殖、分化，或通過趨化臨近組織中間充質(zhì)干細胞向創(chuàng)面組織遷移并誘導其向表皮細胞分化。其應用形式可以為局部應用或采用基因治療的方式進行。 將EGF基因?qū)肽繕思毎梢圆捎觅|(zhì)粒、病毒載體等方式，而其中以AdEasy腺病毒重組系統(tǒng)應用最為廣泛，其具有以下優(yōu)勢：①宿主范圍廣，對人致病性低。②可以在增殖和非

7、增殖細胞中感染并表達目的基因，而逆轉(zhuǎn)錄病毒由于只能感染增殖性細胞，DNA轉(zhuǎn)染不能在非增殖細胞中進行，而必須使細胞處于持續(xù)培養(yǎng)狀態(tài)。③能有效進行增殖，產(chǎn)生的病毒滴度較高。④無需輔助病毒，可容納7.5kb外源DNA，且與人類基因同源。⑤不整合到宿主細胞染色體中，無插入致突變性。⑥能同時表達多個基因。基于此，我們首次報道將EGF基因成功導入腺病毒載體，并經(jīng)過酶切和測序鑒定構(gòu)建的腺病毒載體中含有完整的EGF基因。測定病毒滴度為4.4×108PF

8、U/ml，可以滿足基因治療的需要。 將Ad-EGF轉(zhuǎn)染人ADSCs實驗中發(fā)現(xiàn)，在病毒液為MOI=50轉(zhuǎn)染ADSCs，48小時后感染效率高達90％，說明ADSCs可以作為基因治療的良好靶細胞。對轉(zhuǎn)染EGF基因的ADSCs第四代染色體分析無突變，并對其增殖特性進行檢測，與未轉(zhuǎn)染的ADSCs相比生長增殖情況無差異性。同時RT-PCR檢測到培養(yǎng)的轉(zhuǎn)染ADSCs細胞中有EGF基因的表達。酶聯(lián)免疫吸附方法對轉(zhuǎn)基因的ADSCs體外培養(yǎng)24h、

9、48h、72h、96h、120h的細胞上清液中EGF蛋白表達水平進行檢測，結(jié)果表明與未轉(zhuǎn)染的ADSCs比較，轉(zhuǎn)EGF的ADSCs可以持續(xù)分泌一定水平的EGF蛋白。結(jié)果表明成功的構(gòu)建了含EGF基因的腺病毒載體并高效傳染ADSCs，使后者能持續(xù)分泌EGF從而發(fā)揮其生物作用。 盡管轉(zhuǎn)EGF基因的ADSCs直接應用應該能夠促進創(chuàng)面的愈合，但為了更有效的修復創(chuàng)面，將轉(zhuǎn)EGF的ADSCs在體外一定的誘導培養(yǎng)條件下向表皮細胞分化。體外誘導7d

10、后，約43.3％細胞形態(tài)發(fā)生改變，呈不規(guī)則形，并有少許突起，免疫組化檢測有角蛋白K19的表達，與未轉(zhuǎn)基因的ADSCs比較陽性細胞數(shù)目明顯增多。說明轉(zhuǎn)基因的ADSCs在體外一定條件下可以向表皮細胞分化，轉(zhuǎn)EGF基因不影響ADSCs的體外分化相反能促進其分化。 進一步將誘導后的轉(zhuǎn)EGF基因ADSCs移植于裸鼠皮膚缺損模型，對創(chuàng)面修復面積及修復后組織學檢測發(fā)現(xiàn)，試驗組與對照組1、對照組2和空白組比較，修復的速度明顯加快，形成的新生表皮