人脂肪干細(xì)胞向表皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、【研究背景】
　　皮膚缺損是外科中的常見(jiàn)問(wèn)題。盡早封閉創(chuàng)面，減少機(jī)體消耗和內(nèi)環(huán)境紊亂是治療皮膚缺損的關(guān)鍵。燒傷外科中大面積燒傷病人皮源缺乏，自體皮膚移植是目前臨床治療全層皮膚缺損最有效的方法。但是自體刃厚皮移植皮片易收縮，不耐摩擦，中厚皮有瘢痕攣縮等問(wèn)題。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，皮膚替代物的研究取得了實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展。種子細(xì)胞的體外培養(yǎng)、擴(kuò)增是組織工程學(xué)研究中最基礎(chǔ)的工作。
　　2001年，Zuk[1]等首次分離培養(yǎng)出能夠自我復(fù)

2、制、穩(wěn)定增殖，并具有多向分化潛能的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。ADSCs來(lái)自中胚層，在特定條件下可分化為脂肪、骨、軟骨、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等[1‐4]。ADSCs具有來(lái)源豐富、方便取材、低免疫原性、容易體外擴(kuò)增等優(yōu)點(diǎn)，在組織工程、創(chuàng)面修復(fù)及基因治療方面具有良好的應(yīng)用前景。近年來(lái)研究表明，ADSCs在體外培養(yǎng)過(guò)程中加入不同的刺激因子，模擬皮膚的微環(huán)境，能誘導(dǎo)成為具有各種表型的細(xì)胞。Ramos等[5]證實(shí)，將分選純化后的ADSCs植入裸鼠體內(nèi)

3、，可顯著促進(jìn)創(chuàng)面愈合，且具有表皮細(xì)胞再生的能力。人角質(zhì)形成細(xì)胞是皮膚創(chuàng)面修復(fù)的重要細(xì)胞，而表皮生長(zhǎng)因子（epithelialgrowthfactor，EGF）是創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中的關(guān)鍵因子。EGF能促進(jìn)細(xì)胞增殖、表皮再生、血管形成，同時(shí)能刺激表皮細(xì)胞合成分泌膠原、透明質(zhì)酸等細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)結(jié)締組織細(xì)胞的生長(zhǎng)[6]。Shikiji等[7]成功地應(yīng)用EGF誘導(dǎo)體外培養(yǎng)于立體膠原表面的人表皮細(xì)胞向膠原內(nèi)生長(zhǎng)并形成汗腺管結(jié)構(gòu)。因此，本實(shí)驗(yàn)研究利用p

4、cDNA3.1(+)/SP+EGF質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的HaCat細(xì)胞誘導(dǎo)人ADSCs體外轉(zhuǎn)化為表皮細(xì)胞表型的可行性，為其在組織工程中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　【研究目的】
　　1、探索高效分離和擴(kuò)增人脂肪干細(xì)胞的方法，觀察其生物學(xué)特性，并通過(guò)形態(tài)學(xué)、免疫表型及多向分化能力進(jìn)行鑒定。
　　2、探索人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向表皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的方法。
　　【研究?jī)?nèi)容】
　　1、膠原酶消化法分離培養(yǎng)ADSCs，利用形態(tài)

5、學(xué)及MTT比色法觀察細(xì)胞生物學(xué)特性。
　　2、通過(guò)流式細(xì)胞儀及誘導(dǎo)多向分化鑒定ADSCs。
　　3、利用轉(zhuǎn)染EGF的HaCat細(xì)胞，與ADSCs共培養(yǎng)，誘導(dǎo)ADSCs向表皮細(xì)胞分化。
　　4、利用外源性EGF誘導(dǎo)ADSCs向表皮細(xì)胞分化。
　　【研究結(jié)果】
　　1、原代和傳代細(xì)胞呈梭形外觀，生長(zhǎng)增殖能力良好。細(xì)胞傳代后2天內(nèi)處于潛伏期，第3天進(jìn)入生長(zhǎng)期，5天后進(jìn)入平臺(tái)期。
　　2、流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD2

6、9、CD31、CD34、CD45、CD90、CD105陽(yáng)性率分別為73.4％、3.6％、4.5％、2.0％、97.3％、80.4％。經(jīng)定向誘導(dǎo)分化后，細(xì)胞分別呈現(xiàn)脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞的表型特征。
　　3、ADSCs與轉(zhuǎn)染EGF的HaCat細(xì)胞共培養(yǎng)后ADSCs表達(dá)表皮細(xì)胞特征性表面抗原，提示利用此方法可誘導(dǎo)ADSCs向表皮細(xì)胞分化。
　　4、加入EGF刺激后ADSCs中表皮細(xì)胞表面抗原CK19、integrin-β的mRNA水平

7、隨時(shí)間增加而上升，誘導(dǎo)4w后時(shí)表達(dá)最高。
　　【研究結(jié)論】
　　1、酶消化法能有效分離純化人ADSCs，細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定，增殖能力活躍，具有ADSCs的一般生物學(xué)特性。
　　2、轉(zhuǎn)染EGF的HaCat細(xì)胞可誘導(dǎo)ADSCs向表皮細(xì)胞表型分化，從而為其成為組織工程理想的種子細(xì)胞提供了進(jìn)一步的支持。
　　3、EGF在誘導(dǎo)ADSCs向表皮細(xì)胞分化的過(guò)程中起著決定性作用，
　　4、合理有效地利用ADSCs在創(chuàng)面愈合的研究