人表皮細胞中側(cè)群細胞表型的初步分析.pdf

1、皮膚是人體最大的組織器官，也是始終處于不斷更新狀態(tài)的組織之一。皮膚組織這種不斷的更新是由位于表皮基底層以及毛囊隆突部的表皮干細胞維持的。表皮干細胞的重要性不僅在于它們在創(chuàng)傷修復和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定過程中具有重要作用，而且在于它們是腫瘤發(fā)生的起始細胞和基因治療的主要靶標。因此，表皮干細胞一直是近年來研究的熱點。而如何將表皮干細胞從皮膚組織中準確的分離純化、培養(yǎng)和鑒定，是研究表皮干細胞的最基本條件。但是由于表皮干細胞數(shù)量較少，且缺乏特異性分子標

2、志，分離鑒定存在一定困難。最近研究有一種不依賴細胞表面標志物的干細胞分離方法——側(cè)群細胞分離法，正越來越多地被廣大研究者應用。側(cè)群（side population）細胞又稱SP細胞，是指一類能夠?qū)⑦M入細胞核的親脂性染料排出胞外的細胞。該方法最初是在對造血干細胞的研究中發(fā)現(xiàn)的，其基本原理就是利用了干細胞能表達ABC轉(zhuǎn)運蛋白從而可以將進入胞內(nèi)的DNA結(jié)合熒光染料Hoechst33342主動轉(zhuǎn)運出胞外這一特異性功能。該SP細胞群在紫外光激發(fā)下

3、，表現(xiàn)低熒光的特性，可以應用流式細胞儀將其分選出來。在人多種成體組織，如肝、肺、腦、神經(jīng)、小腸、氣管中都發(fā)現(xiàn)了SP細胞，該類細胞群高表達干細胞的標志物，具有干細胞的特性，富含干細胞。 目的： 檢測人表皮細胞中是否含有SP細胞，并研究該表型細胞是否高表達通用干細胞標志物ABCG2、表皮干細胞標志物整合素α6和β1，分析SP細胞是否是表皮干細胞，為進一步分離和研究表皮干細胞提供線索和基礎。 方法： 1、表皮單

4、細胞懸液獲取和細胞培養(yǎng)：收集86例16～25歲包皮環(huán)切術患者（無泌尿系感染）術后包皮組織。無菌條件下徹底清洗，去除皮下組織，經(jīng)兩步酶消化法分離獲得表皮單細胞懸液，接種于鋪有人胎盤Ⅳ型膠原的培養(yǎng)瓶中，用K—SFM細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。 2、細胞染色和SP細胞分選：取培養(yǎng)的第2～4代表皮細胞，消化成單細胞懸液，一組加入DNA結(jié)合熒光染料Hoechst33342，另一組同時加入維拉帕米作為對照，染色后加入碘化丙錠，用流式細胞儀分選SP細胞。

5、 3、ABCG2、整合素α6和β1表達分析：收集分選的SP細胞，流式細胞儀和RT—PCR分析通用干細胞標志物ABCG2、表皮干細胞標志物整合素α6和β1在SP細胞中的表達情況，以同一標本總表皮細胞作為對照組。 4、統(tǒng)計學處理：數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行配對u檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果： 1、表皮細胞培養(yǎng)24h，可見部分細胞貼壁生長。5d細胞長滿單層，貼壁細胞

6、呈多角形，胞漿透亮，胞核較大，呈現(xiàn)典型的鋪路石狀。7d細胞大部融合成片。 2、人表皮細胞中存在SP細胞，比例為0.2％～0.3％，維拉帕米阻斷后 SP細胞比例減少（<0.01％）。 3、流式細胞儀和RT—PCR檢測到SP細胞中有少數(shù)細胞表達干細胞標志物ABCG2以及表皮干細胞的標志物整合素α6和β1。 4、經(jīng)統(tǒng)計學分析，干細胞標志物ABCG2、表皮干細胞標志物整合素α6以及整合素β1在SP細胞中的表達率和在總表皮

7、細胞中的表達率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。 結(jié)論： 1、人表皮細胞中存在SP細胞，比例為0.2％～0.3％。 2、流式細胞儀和RT—PCR檢測到SP細胞表達干細胞標志物ABCG2以及表皮干細胞的標志物整合素α6和β1，但與總表皮細胞比較，這些干細胞標志物在SP細胞中的表達無明顯增高。 3、 SP細胞分離法分選到的細胞可能不是純化的表皮干細胞，該方法并不能分離高純度的人表皮干細胞，尚需進一步對表皮干細