表皮干細(xì)胞分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)人表皮細(xì)胞向表皮干細(xì)胞逆向分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、對(duì)燒傷患者行角質(zhì)形成細(xì)胞移植用于覆蓋創(chuàng)面的歷史由來(lái)已久，如今為了更好的修復(fù)由燒傷等所致的皮膚缺損，闡明創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中的主要機(jī)制，人們對(duì)表皮干細(xì)胞的分化和分布進(jìn)行了積極的探索。然而，體外培養(yǎng)條件下，表皮干細(xì)胞的生物學(xué)特性與體內(nèi)三維環(huán)境下表皮干細(xì)胞的生物學(xué)特性仍有相當(dāng)不同，表皮干細(xì)胞來(lái)源及在創(chuàng)傷修復(fù)中細(xì)胞的分化機(jī)制還遠(yuǎn)未闡明：這些在基底層的表皮干細(xì)胞為什么源源不斷的分化而不衰竭，他們是如何來(lái)進(jìn)行分化選擇的?隨著對(duì)干細(xì)胞可塑性的認(rèn)識(shí)，表皮干細(xì)

2、胞是否有其它的來(lái)源途徑?例如由其它干細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來(lái)或是由已分化的表皮細(xì)胞在特定的條件下逆分化而來(lái)的結(jié)果?本研究通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)及在體試驗(yàn)對(duì)上述問(wèn)題進(jìn)行了初步探討，分析皮膚修復(fù)過(guò)程中表皮干細(xì)胞增殖、分化及分布的異位性，試圖求證表皮細(xì)胞有可能向表皮干細(xì)胞方向逆分化的假設(shè)，以期豐富創(chuàng)傷修復(fù)理論。 一、表皮干細(xì)胞的體外培養(yǎng)及EGF的誘導(dǎo)：以往人們對(duì)表皮干細(xì)胞的研究多集中在分離、培養(yǎng)及鑒定等上。要想獲取臨床上需要的干細(xì)胞量，代價(jià)較為昂貴。表

3、皮干細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)如Ⅳ型膠原有較好的粘附性。為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)表皮干細(xì)胞對(duì)Ⅳ型膠原的黏附特性，評(píng)價(jià)重復(fù)利用Ⅳ膠原以差速黏附法在分選表皮干細(xì)胞中的效果；同時(shí)以EGF誘導(dǎo)干細(xì)胞，以期維持干細(xì)胞的克隆狀態(tài)，獲取更多得廉價(jià)表皮干細(xì)胞。選用包皮環(huán)切術(shù)患者包皮作為組織標(biāo)本，用酶消化法分離表皮細(xì)胞，以Ⅳ型分選表皮干細(xì)胞，建立表皮干細(xì)胞的培養(yǎng)體系，通過(guò)免疫組織化學(xué)方法及觀察增殖現(xiàn)象等方法對(duì)表皮干細(xì)胞進(jìn)行鑒定；以表皮生長(zhǎng)因子(EGF)誘導(dǎo)表皮干細(xì)胞增殖和分化

4、，通過(guò)表皮干細(xì)胞的傳代次數(shù)、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)傳代后CK19陽(yáng)性細(xì)胞的百分比來(lái)分析EGF在減緩表皮干細(xì)胞衰老進(jìn)而在創(chuàng)傷修復(fù)中的作用；結(jié)果表明：①表皮干細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)Ⅳ型膠原有良好的黏附特性，在以Ⅳ型膠原包被的培養(yǎng)瓶中細(xì)胞貼壁多且后期生長(zhǎng)良好；②培養(yǎng)基中添加適量的EGF可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖和增加傳代次數(shù)； 二、超薄表皮片在體移植試驗(yàn)：皮片移植是燒傷治療中最常用的手術(shù)方式。臨床上移植的刃厚皮片往往包含基底層及少量的真皮，皮片移

5、植后基底層細(xì)胞的分布和分化現(xiàn)象，鮮見(jiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道。用酶消化法分離包皮環(huán)切術(shù)患者包皮表皮，以熒光示蹤劑DAPI標(biāo)記經(jīng)預(yù)處理的表皮片，將此超薄表皮片移植于裸鼠創(chuàng)面，分別在第4天和第7天活殺取材，制作HE、石蠟與冰凍切片。用免疫組化的方法評(píng)估表達(dá)角蛋白19和14細(xì)胞的特征和分布。染色顯示：移植的皮片細(xì)胞層次有松弛紊亂的跡象，冰凍切片在基底層之外亦見(jiàn)有少量孤立雙染的CK19陽(yáng)性細(xì)胞。這些現(xiàn)象在移植后的第4天最為顯著，但未觀察到孤立成團(tuán)的“干細(xì)胞島

6、”現(xiàn)象。這種特異性細(xì)胞的異位可能是維持皮片的活力、參與創(chuàng)面的修復(fù)以及之后表皮重構(gòu)的其始動(dòng)因素。 三、機(jī)械應(yīng)力對(duì)皮膚干細(xì)胞增殖和分化的影響：皮膚軟組織擴(kuò)張術(shù)是將皮膚軟組織擴(kuò)張器經(jīng)手術(shù)植入皮膚軟組織下，通過(guò)定期注水使其不斷擴(kuò)張，使表面的皮膚軟組織逐漸擴(kuò)展延伸，從而達(dá)到修復(fù)皮膚缺損、重建功能及恢復(fù)外貌的目的。目前，對(duì)軟組織擴(kuò)張術(shù)的細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制研究報(bào)道不多，大多數(shù)研究?jī)H證實(shí)擴(kuò)張后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞間距增大，但更深層次的原因如皮膚干

7、細(xì)胞的特性有無(wú)相應(yīng)性變化?目前尚不清楚。機(jī)械應(yīng)力下表皮干細(xì)胞的生物學(xué)變化將有助于闡明組織擴(kuò)張的機(jī)制。 本實(shí)驗(yàn)率先對(duì)軟組織擴(kuò)張后人的皮膚(頭皮和頸部皮膚)干細(xì)胞進(jìn)行研究，探討外界機(jī)械應(yīng)力是否對(duì)皮膚干細(xì)胞增殖、分化和分布有影響，為臨床軟組織擴(kuò)張術(shù)的應(yīng)用提供理論支持。通過(guò)病理切片免疫組織化學(xué)染色的方法觀察在機(jī)械應(yīng)力等作用下在體皮膚干細(xì)胞的增殖、分化和分布特征，結(jié)果顯示擴(kuò)張后的皮膚可見(jiàn)明顯的CK19陽(yáng)性細(xì)胞細(xì)胞增多，初步表明外界機(jī)械應(yīng)力