去分化來源表皮干細(xì)胞的誘導(dǎo)及應(yīng)用研究.pdf

1、目的：1.通過建立表皮細(xì)胞去分化的三種體外模型，對比三種去分化來源的表皮干細(xì)胞(dedifferention epidermal stem cells，DESCs)和原始表皮干細(xì)胞(epidermal stem cells，ESCs)的細(xì)胞形態(tài)和免疫表型，從中篩選出高效率的去分化誘導(dǎo)方法；2.將DESCs移植入裸鼠(BALB/c mice)背部創(chuàng)面，觀察其對創(chuàng)面愈合的促進(jìn)作用。
　　 方法：1.由人新鮮的包皮標(biāo)本中分離獲得ESC

2、s，通過傳代培養(yǎng)獲得成熟的表皮細(xì)胞(epidermal cells，ECs)，倒置顯微鏡下觀察兩種細(xì)胞的形態(tài)、免疫組化檢測細(xì)胞表型、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及增殖指數(shù)。2.取同一包皮分離的ESCs，隨機(jī)均分為5組，將其中一組ESCs作為原始表皮干細(xì)胞進(jìn)行凍存待檢測，其余4組進(jìn)行培養(yǎng)傳代，獲得成熟的ECs。再分別以熱、雙氧水(H2O2)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)處理其中的3組ECs，并在處理后3d、7d、14d將3組去分化細(xì)胞與E

3、SCs和ECs兩對照組一起進(jìn)行相關(guān)檢測：以倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)改變；細(xì)胞免疫組織化學(xué)觀察B1整合素、CK10、CK19等表型的變化；隨機(jī)選10個視野做B1整合素陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。3.建立裸鼠背部創(chuàng)面模型，麻醉下在每個裸鼠背部脊柱兩側(cè)制備2個直徑為6mm的圓形創(chuàng)面，直至深筋膜，共24個創(chuàng)面。將24個創(chuàng)面隨機(jī)分為DESCs、ESCs、ECs、生理鹽水(normal saline，NS)組等4組，每組6個創(chuàng)面。分別消化離心以DA

4、PI標(biāo)記的DESCs、ESCs、ECs，加入適量NS使細(xì)胞懸液終濃度都為2×106個/ml。用1ml注射器分別將DESCs、ESCs、ECs和NS注射于相應(yīng)創(chuàng)緣皮下及創(chuàng)面基底部，劑量為每個創(chuàng)面0.2ml.于術(shù)后0d、3d、7d統(tǒng)計(jì)創(chuàng)面面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；在術(shù)后7d進(jìn)行創(chuàng)面取材制片，熒光顯微鏡觀察標(biāo)記DAPI的DESCs、ESCs、ECs在創(chuàng)面的分布情況；創(chuàng)面取材制片行HE染色對比創(chuàng)面的愈合情況。
　　 結(jié)果：1.新鮮分離的ESC

5、s小圓珠狀，核大，核漿比高，細(xì)胞貼壁生長后連接成片成鋪路石樣，免疫組化顯示其β1整合素、CK19表達(dá)呈陽性，CK10表達(dá)陰性；ECs則寬大扁平，形態(tài)不規(guī)則，核小，核漿比低，無法形成克隆，其CK10表達(dá)呈陽性，β1整合素、CK19表達(dá)陰性.ESCs處于增殖期(G2/M)的細(xì)胞比例要高于ECs.2.三種DESCs在3d、7d、14d的β1整合素陽性細(xì)胞數(shù)均高于ECs組(p<0.01)；應(yīng)用bFGF處理獲得的DESCs在3d和7d的β1整合素

6、陽性細(xì)胞數(shù)要高于其它兩種處理組(p<0.01)；三種DESCs在14d時的β1整合素陽性細(xì)胞數(shù)無明顯差異(p>0.05)，和原始ESCs相比亦無明顯差異(p>0.05).3.創(chuàng)面愈合實(shí)驗(yàn)中DESCs組和ESCs組在術(shù)后3d和7d的創(chuàng)面面積均小于ECs組和NS組(p<0.01)，DESCs組和ESCs組在術(shù)后3d和7d的創(chuàng)面面積則無明顯差異(p>0.05).熒光顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)術(shù)后7d用DAPI標(biāo)記的DESCs和ESCs在皮膚和皮下組織內(nèi)皆