蛋白激酶C抑制劑誘導(dǎo)表皮細(xì)胞去分化及microRNAs差異表達(dá)的研究.pdf

1、目的：探討蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）抑制劑GF109203X誘導(dǎo)表皮細(xì)胞去分化形成表皮樣干細(xì)胞的可能性及誘導(dǎo)前后微小RNA（micro-RNA,miRNA）的差異表達(dá)分析。
　　方法：
　?。?）采用酶消化法分離培養(yǎng)人原代表皮細(xì)胞。
　?。?）將獲得的細(xì)胞隨機(jī)分為2組，實(shí)驗(yàn)組：原代表皮細(xì)胞培養(yǎng)2d后加GF109203X，終濃度為10μM；對(duì)照組：同期分離的原代表皮細(xì)胞培養(yǎng)2d后加等體積二甲基

2、亞砜（DMSO）。誘導(dǎo)2d后采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法對(duì)2組細(xì)胞行β1整合素、角蛋白19(cytokeratin19，CK19)、CK14、CK10單克隆抗體檢測(cè)鑒定。
　?。?）TRIzol法提取2組細(xì)胞總RNA并用RNeasy Mini Kit純化，使用NanoDrop ND-1000測(cè)量純化后的RNA濃度，變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，miRCURYTM Array Power Labeling kit標(biāo)記樣品并與miRC

3、URYTMLNA Array(v.18.0)雜交芯片，Wash buffer kit清洗芯片后使用Axon GenePix4000B掃描，GenePix pro6.0讀取探針信號(hào)值，對(duì)采集數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化及差異表達(dá)分析，實(shí)時(shí)定量RT-PCR驗(yàn)證微陣列芯片檢測(cè)結(jié)果的可靠性。
　?。?）對(duì)部分差異表達(dá)miRNAs靶基因行功能富集分析。
　　結(jié)果：
　?。?）實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞群誘導(dǎo)培養(yǎng)2d后形成明顯克隆，免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示β1整合

4、素、CK19及CK14呈陽(yáng)性表達(dá)，CK10陰性表達(dá)；對(duì)照組細(xì)胞群培養(yǎng)2d無明顯克隆形成，β1整合素、CK19及CK14呈陰性表達(dá)，CK10呈陽(yáng)性表達(dá)。
　　（2）篩選出實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的miRNAs45個(gè)，表達(dá)下調(diào)的miRNAs34個(gè)。其中顯著上調(diào)的miRNA有hsa-miR-1-3p，hsa-miR-374a-5p，hsa-miR-144-5p等；顯著下調(diào)的miRNA有hsa-miR-31-5p，hsa-let-7c-3p，

5、hsa-miR-514a-3p等。
　　（3）實(shí)時(shí)定量RT-PCR對(duì)表達(dá)上調(diào)最顯著的hsa-miR-1-3p及表達(dá)下調(diào)最顯著的hsa-miR-31-5p進(jìn)行驗(yàn)證，與芯片檢測(cè)結(jié)果具有較好的一致性。
　?。?）miRNAs靶基因功能富集分析提示差異表達(dá)miRNAs參與細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞周期進(jìn)展、凋亡等生物學(xué)過程。
　　結(jié)論：蛋白激酶C抑制劑GF109203X可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)人表皮細(xì)胞去分化形成表皮樣干細(xì)胞，并引起表皮細(xì)胞m