豬表皮干細胞體外分離、培養(yǎng)和建系研究.pdf

1、皮膚的表皮終生處于增殖、分化和脫落的不斷更新之中,這正是由于其中表皮干細胞(Epidermal Stem Cells,ESCs)不斷增殖分化所致.表皮干細胞是一種在體內(nèi)具有無限更新能力,且能分化形成全層表皮的細胞,在體外培養(yǎng)具有長期生長潛能.開展分離純化表皮干細胞建系研究,為表皮干細胞應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床的組織工程和人類重大疾病的細胞治療打下技術(shù)基礎(chǔ).本研究以五指山實驗用小型豬(wu Zhi Shan Pigs,WZSP)近交系的耳組織為材料

2、,分別從不同日齡豬、不同膠原、條件培養(yǎng)基和表皮生長因子等方面對ESCs分離培養(yǎng)的影響進行了研究,旨在探索ESCs的最佳分離培養(yǎng)條件,并在該條件下建立三個表皮干細胞系,對所培養(yǎng)的ESCs進行了染色及免疫組化鑒定.得出研究結(jié)果如下:1.不同因素對豬表皮干細胞分離培養(yǎng)的影響研究采集4日齡、1月齡、3月齡、12月齡豬耳組織分離表皮干細胞,分別計算各組細胞的貼率.結(jié)果表明,隨著實驗豬日齡的增長,表皮干細胞的貼壁率逐漸降低,其中4日齡組貼壁率為12

3、.68±1.11﹪,1月齡組為9.76±0.68﹪,根據(jù)ESCs所占表皮細胞約10﹪的比例,這兩組最適宜作為分離純化表皮干細胞的材料. 將分離得到的表皮細胞分為兩組,一組接種于Ⅰ型膠原包被的六孔板中,另一組接種與Ⅳ型膠原包被的六孔板中,15min后洗去未貼壁細胞,計算兩組細胞的貼壁率.結(jié)果表明,Ⅰ型膠原組貼壁率為28.76±1.71﹪,Ⅳ型膠原組貼壁率為11.16±1.43﹪,由此可見,Ⅰ型膠原不適宜作為篩選表皮干細胞的基質(zhì).

4、 將分離純化出的表皮干細胞分為兩組,一組采用條件培養(yǎng)基培養(yǎng),另一組采用DMEM/F12(1:1)+15﹪血清培養(yǎng).結(jié)果表明,條件培養(yǎng)基培養(yǎng)組細胞生長狀況良好,呈克隆狀生長,且傳幾代之后也不易發(fā)生分化,而有血清培養(yǎng)基培養(yǎng)組細胞生長速度非常緩慢,且從第二天開始就出現(xiàn)了分化現(xiàn)象,以后分化細胞逐漸增多,不能夠形成克隆狀.因此,在沒有飼養(yǎng)層的條件下,表皮干細胞的培養(yǎng)必須添加條件培養(yǎng)基. 分離純化出的表皮干細胞分為四組,分別用含Ong

5、/ml,10ng/ml,20ng/ml和30ng/ml表皮生長因子(Epidermal Growth Factor,EGF)的培養(yǎng)液培養(yǎng),繪制每組細胞的生長曲線.結(jié)果表明,10ng/ml、20ng/ml和30ng/ml濃度的EGF下ESCs生長曲線沒有明顯的差別(P>0.05),而不含EGF的培養(yǎng)液細胞增殖速度顯著低于其他各組(P<0.05).2.豬表皮干細胞的建系研究采集WZSP實驗用近交系耳組織,通過中性蛋白酶消化獲得表皮,再通過0

6、.25﹪胰酶+0.02﹪EDTA消化制成單個表皮細胞懸液,接種在Ⅳ型膠原包被的培養(yǎng)瓶內(nèi),采用條件培養(yǎng)基(DMEM/F12(1:1)+10﹪條件培養(yǎng)液+5μg/mL insulin+20ng/mL EGF+20ng/mL IGF-I+0.5 μg/mL氫化可的松)培養(yǎng),0.25﹪胰酶消化傳代.表皮干細胞能夠快速黏附在Ⅳ型膠原上,呈克隆狀生長,一般傳代間隔為7天左右.已建立三個表皮干細胞系,均已傳至20代以上.3.豬表皮干細胞的鑒定及分化研