體外誘導(dǎo)人脂肪組織來源的干細(xì)胞向角膜上皮樣細(xì)胞分化的初步研究.pdf

1、目的:
　　 1.分離、培養(yǎng)和鑒定不同供體性狀(手術(shù)切除脂肪組織塊及吸脂術(shù)脂肪懸液)的人脂肪組織來源的干細(xì)胞(ADSCs)。觀察其生物學(xué)特性、干細(xì)胞活性的差異。
　　 2.體外模擬角膜上皮生長、分化的微環(huán)境，對不同方法提取的人ADSCs進(jìn)行單獨/聯(lián)合誘導(dǎo)，探討其向角膜上皮樣細(xì)胞分化的潛在能力，及誘導(dǎo)分化的可行途徑。
　　 方法:
　　 1.改良方法分離、純化人ADSCs，使用改良的體外擴增培養(yǎng)液進(jìn)行體外培

2、養(yǎng)。
　　 2.MTT法測定ADSCs增殖曲線。流式細(xì)胞儀檢測傳3～5代的CD29、CD34、CD49d、CD105、CD106表達(dá)率。進(jìn)行成脂、成骨多向誘導(dǎo)，2周后用油紅O及堿性磷酸酶法鑒定分化能力。對2種性狀提取之細(xì)胞的表型及增殖、分化能力進(jìn)行比較。
　　 3.應(yīng)用CFDASE標(biāo)記人ADSCs。采用組織塊培養(yǎng)法體外提取大鼠角膜上皮細(xì)胞，并制作無上皮、內(nèi)皮細(xì)胞的大鼠角膜基質(zhì)，用于ADSCs的聯(lián)合誘導(dǎo)。
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3、.CFDASE標(biāo)記的人ADSCs與大鼠角膜上皮細(xì)胞各自爬片，并列培養(yǎng)于同一體系，觀察人ADSCs遷徙情況。
　　 5.在不同培養(yǎng)液體系(角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)體系、間充質(zhì)細(xì)胞體外擴充培養(yǎng)體系及上述二者等積混合的中間體系)內(nèi)添加梯度濃度0～50ng/mLEGF，及50ng/mLEGF基礎(chǔ)上添加的10，20ng/mLbFGF，對ADSCs進(jìn)行單獨誘導(dǎo)。采取光鏡、電鏡、免疫組織化學(xué)染色、免疫熒光染色的手段，觀察誘導(dǎo)21d后ADSCs形態(tài)學(xué)的改變

4、及角膜特異性蛋白AE5(CK3/CK12)的表達(dá)情況，比較不同培養(yǎng)體系及不同濃度生長因子對ADSCs誘導(dǎo)作用的差異。
　　 6.在Transwell體系上層放置大鼠角膜上皮細(xì)胞或角膜基質(zhì)，下層放置人ADSCs，選擇不添加/添加40ng/mLEGF的角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)體系對人ADSCs進(jìn)行聯(lián)合誘導(dǎo)，采用免疫熒光染色法觀察誘導(dǎo)30d后ADSCs細(xì)胞角蛋白譜AE1和角膜特異性蛋白AE5的表達(dá)情況，比較添加/不添加EGF、單獨誘導(dǎo)/角膜上皮細(xì)

5、胞聯(lián)合誘導(dǎo)/角膜基質(zhì)聯(lián)合誘導(dǎo)對人ADSCs誘導(dǎo)成功率的差異。
　　 7.單獨誘導(dǎo)2種性狀提取的ADSCs，比較誘導(dǎo)后30d二者AE1、AE5陽性率差異。
　　 結(jié)果:
　　 1.不論脂肪塊還是脂肪懸液，均可通過上述方法獲取大量高純度的ADSCs。但后者的操作流程更為省時、省力，獲取的細(xì)胞量相對較多。流式細(xì)胞儀測定傳3代至傳5代的ADSCs，兩個不同供體性狀的細(xì)胞均為CD34-、CD106-、CD29+、CD49d

6、+、CD105+。皮下組織塊來源的ADSCs傳3代的表型CD29+、CD49d+細(xì)胞分別占82.5％和8.0％，傳至5代逐漸增加為89.4％、70.1％；CD105+細(xì)胞則穩(wěn)定于80％左右。吸脂術(shù)提取的ADSCs傳3～5代的表型較為穩(wěn)定，CD29+、CD49d+、CD105+表達(dá)分別在99％、40％、80％左右，與皮下組織塊組比較，傳3～5代的CD29和傳5代的CD49d陽性率有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。MTT比色法顯示，ADSCs增

7、殖活性隨傳代次數(shù)增加而增加。另外，ADSCs分別進(jìn)行成脂/成骨體外誘導(dǎo)，2周后油紅O、堿性磷酸酶染色，均見陽性結(jié)果，皮下組織塊組2者陽性率分別為81.6％、26.5％，吸脂術(shù)組為64.6％、29.3％02.CFDASE標(biāo)記的ADSCs在營養(yǎng)狀態(tài)欠佳的角膜上皮細(xì)胞誘導(dǎo)下遷徙、并逐漸包繞、替代后者。另外，角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)體系培養(yǎng)下的ADSCs向角膜上皮樣細(xì)胞分化的陽性率具有EGF濃度依賴性；bFGF則對分化有抑制性作用。而另2個體系對各濃度EG

8、F、bFGF對ADSCs誘導(dǎo)作用均為陰性。
　　 3.相同培養(yǎng)體系作用下的不同誘導(dǎo)組，以添加EGF刺激下的角膜基質(zhì)聯(lián)合誘導(dǎo)組AE5+ADSCs的比例最高，可達(dá)97.7％，AE1表達(dá)則為0，提示向成熟的角膜上皮樣細(xì)胞分化。其次為單獨誘導(dǎo)組，AE5+比率為75.4％(添加EGF)、46.0％(未添加EGF)，AE1+比率為86.0％(添加EGF)、96.5％(未添加EGF)，分化欠成熟。未添加EGF刺激下的角膜基質(zhì)聯(lián)合誘導(dǎo)組AE5、

9、AE1陽性率最低，分別為2.4％、51.2％。
　　 4.角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)體系下，皮下組織塊組在EGF的刺激下AE5+100％、AE1-0％，而無EGF的作用下則分別為16.6％、97.7％。該組細(xì)胞分化能力強于吸脂術(shù)組。
　　 結(jié)論:
　　 1.本研究通過改良的方法，成功地從人皮下脂肪組織及吸脂術(shù)廢棄液中分離、培養(yǎng)了高純度脂肪組織來源的干細(xì)胞，并經(jīng)體外條件誘導(dǎo)證實具備多向分化潛能，可以作為一種優(yōu)良的組織工程、細(xì)胞治

10、療和基因治療的種子細(xì)胞。
　　 2.本研究中，在Transwell體系內(nèi)，添加40ng/mLEGF的角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液聯(lián)合角膜基質(zhì)進(jìn)行誘導(dǎo)，是體外誘導(dǎo)ADSCs向角膜上皮樣細(xì)胞分化的最佳方法。另外，皮下脂肪組織來源的ADSCs具備更好的分化能力，更適用于將來的臨床治療；而吸脂術(shù)提取的細(xì)胞由于工序相對簡單、來源更為充足，更適用于實驗室研究。
　　 3.CFDASE是一種穩(wěn)定的細(xì)胞示蹤劑，可作為今后體內(nèi)動物實驗的細(xì)胞示蹤的很好手