表皮干細胞多向分化潛能特征的發(fā)現(xiàn)及其相關(guān)研究.pdf

1、目的：⑴探討表皮干細胞(epidermal stem cells,ESCs)潛在亞群及分析其解剖分布特點；⑵建立ESCs轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)方法,拓展ESCs多向分化潛能；⑶明確ESCs體外培養(yǎng)表達譜特征,初步建立ESCs非轉(zhuǎn)基因重編程為誘導(dǎo)的多潛能干細胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)實驗體系。
　　 方法：①應(yīng)用免疫組織化學的方法檢測不同解剖部位皮膚組織CD34的表達。利用RT-PCR技術(shù)及

2、免疫熒光染色技術(shù),從mRNA及蛋白水平檢測包皮來源表皮基底層細胞CD34分子表達情況,并從蛋白水平研究ESC特異性標記β1整合素,p63與CD34雙標記的情況。將標本按照年齡分組,應(yīng)用流氏比較不同年齡組CD34各表位表達的統(tǒng)計學差異。②采用經(jīng)典方法富集包皮來源未分化角質(zhì)細胞(undifferentiatied keratinocytes,UKs),通過流氏及免疫熒光方法檢測UKs特異性標記,評價Epilife培養(yǎng)體系對UKs的生長增殖作

3、用,并通過檢測fibroenctin,nestin,c-kit排除可能的其他種類細胞的污染,保證UKs純度。UKs生長到密度為80％-95％時做為誘導(dǎo)初始細胞,分別采用直接血清誘導(dǎo)法、直接定向誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)法和馴化誘導(dǎo)法進行誘導(dǎo)。檢測成脂相關(guān)mRNA及油紅O染色證實脂肪系列轉(zhuǎn)分化,檢測成肌相關(guān)mRNA及SMA免疫熒光染色證實肌肉系列轉(zhuǎn)分化,檢測成神經(jīng)相關(guān)mRNA水平及nestin,β3-tubulin,GFAP免疫熒光染色證實神經(jīng)系列轉(zhuǎn)

4、分化。血清誘導(dǎo)包皮來源皮膚組織全層碎塊,模擬創(chuàng)傷局部血清滲出條件,免疫熒光檢測角質(zhì)細胞的細胞類型轉(zhuǎn)變。建立小鼠損傷模型,選取不同時間點利用免疫熒光技術(shù)檢測創(chuàng)傷局部角質(zhì)細胞細胞類型轉(zhuǎn)變。③mRNA水平檢測體外培養(yǎng)ESCs表達譜的動態(tài)變化特征(特別是多潛能轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)鍵性調(diào)控分子)。通過轉(zhuǎn)染OCT4,SOX2,KLF4,c-Myc轉(zhuǎn)基因手段重編程ESCs,或是體外通過胚胎干細胞培養(yǎng)環(huán)境直接誘導(dǎo)ESCs去分化,均通過堿性磷酸酶染色及免疫熒光方法

5、檢測多潛能轉(zhuǎn)錄分子OCT4,SSEA1,NANOG驗證iPSCs的產(chǎn)生,將獲得iPSCs樣克隆進行擬胚體實驗,以證實誘導(dǎo)的iPSCs的多能性。
　　 結(jié)果：⑴CD34分子三種表位在人的頭皮及包皮有所表達,但是在軀干皮中未檢測到。這體現(xiàn)CD34分子在不同解剖部位的非均衡性分布。CD34陽性細胞多位于表皮突底部,這是ESCs的居所。免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)包皮分離表皮基底層細胞中β1整合素及p63陽性細胞要多于CD34表達陽性細胞,并且CD

6、34表達陽性細胞同時表達β1整合素和p63。β1整合素,p63及CD34陽性細胞均隨傳代,陽性表達率呈現(xiàn)下降趨勢.體外培養(yǎng)第6代時,CD34陽性細胞完全消失,只存在少量的β1整合素和p63陽性細胞.另外.我們發(fā)現(xiàn)CD34陽性細胞并不隨著供體年齡的增加出現(xiàn)顯著性變化。⑵應(yīng)用體外細胞馴化誘導(dǎo)策略,能夠?qū)崿F(xiàn)UKs多向分化.包皮來源Uks在Eplife培養(yǎng)體系中處于高增殖、不分化狀態(tài).研究發(fā)現(xiàn),UKs直接置于血清或是定向分化培養(yǎng)基中,UKs只是

7、定向分化為表皮細胞。然而,血清按照一定的比例逐漸增量加入到Eplife培養(yǎng)體系中,即血清馴化誘導(dǎo),可以在3周之內(nèi)將UKs非定向轉(zhuǎn)分化為平滑肌細胞、肌成纖維母細胞及少量的脂肪細胞及神經(jīng)細胞。相比之下,系列定向分化培養(yǎng)基與Eplife的聯(lián)合馴化誘導(dǎo)方案,能夠?qū)Ks定向分化為神經(jīng)細胞、脂肪細胞或是肌肉細胞.血清漂養(yǎng)包皮組織48小時(hrs),包皮表皮角質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化為vimentin,FSP陽性細胞.單純包皮表皮漂養(yǎng)48hrs,表皮基底層細胞

8、能夠轉(zhuǎn)分化為SMA陽性細胞.小鼠體內(nèi)模型動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷修復(fù)過程中創(chuàng)緣角質(zhì)細胞能夠轉(zhuǎn)分化為vimentin,FSP陽性細胞,但是始終未見SMA陽性細胞出現(xiàn)。⑶體外培養(yǎng)的ESCs確實存在多潛能轉(zhuǎn)錄分子OCT4,SOX2,KLF4,c-Myc,NANOG的滲漏表達,這些分子一致性的在3-5天(d)時達到高峰,這與iPSC產(chǎn)生理論之一——精錄噪聲的理論相一致.流氏檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)3d的ESCs中確實存在OCT4表達陽性細胞,這進一步證實了

9、iPSC產(chǎn)生原理的另外一個理論——精英細胞學說。選用體外培養(yǎng)3-5d的ESCs進行轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)基因重編程,進入胚胎干細胞培養(yǎng)環(huán)境持續(xù)觀察發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因重編程在體外誘導(dǎo)6d時,出現(xiàn)iPSCs樣克隆,非轉(zhuǎn)基因重編程在體外誘導(dǎo)14d時,能夠觀察到iPSC樣克隆,免疫熒光結(jié)果顯示這些克隆表達多潛能轉(zhuǎn)錄分子OCT4,SSEA1,NANOG,同時表達ESCs特異性標記CD29。堿性磷酸酶染色對2種方法重編程的效率進行比較,轉(zhuǎn)基因明顯高于非轉(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)基

10、因為0.3％,非轉(zhuǎn)基因為0.00002-0.00015％。另外,體外iPSCs樣克隆能夠形成擬胚體,提示其具有發(fā)育能力。
　　 結(jié)論：①系統(tǒng)性的研究CD34三種表位在不同解剖部位的表達情況,初步顯示CD34可能在頭皮及包皮組織中代表了ESCs的一個亞群,并且CD34在不同解剖部位存在不均衡性進一步證實了干細胞異質(zhì)性的特征。②研究數(shù)據(jù)顯示人的UKs在體外具有多向分化能力.另外,通過小鼠的創(chuàng)傷模型也證實在創(chuàng)傷修復(fù)過程中存在角質(zhì)細胞向