經(jīng)血源性子宮內(nèi)膜干細胞的生物學(xué)特性及多向分化潛能的實驗研究.pdf

1、目的:現(xiàn)階段，用于研究干細胞的主要材料來源于胚胎干細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞，但這兩種來源的干細胞都存在著部分的局限性，例如涉及創(chuàng)傷性、倫理道德性等，所以現(xiàn)臨床急需要尋找一種新型的干細胞以避免上述干細胞標本倫理學(xué)的爭議、來源的缺乏及腫瘤形成的潛在性等弊端。本實驗主要研究來源于經(jīng)血的經(jīng)血源性子宮內(nèi)膜干細胞(menstrual blood-derived mesenchymal stem cells。MenSCs)在體外獲取及培養(yǎng)增殖的方法并鑒

2、定，觀察細胞的形態(tài)及生長情況等基本生物學(xué)特性以及體外誘導(dǎo)其向成骨細胞成脂細胞方向分化以及重點實驗體外誘導(dǎo)其向子宮內(nèi)膜上皮和間質(zhì)細胞方向分化的可行性及不同濃度雌激素對分化結(jié)果的影響。為其在臨床中的應(yīng)用奠定一定基礎(chǔ)。
　　方法:本實驗采用Ficoll密度梯度法從月經(jīng)第二天健康女性經(jīng)血中分離MenSCs,采用經(jīng)典的MTT法對體外擴增的第一代、第二代細胞描繪生長曲線，并通過傳代培養(yǎng)、體外擴增,使用倒置光學(xué)顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及在培養(yǎng)過程中

3、的動態(tài)增殖變化。第二代細胞經(jīng)流式細胞儀檢測免疫表型的表達情況。取第二代 MenSCs,分成誘導(dǎo)組和對照組。分別按5×104/mL接種至明膠包被的6孔板中,24小時細胞貼壁后。誘導(dǎo)組培養(yǎng)液更換成干細胞成骨誘導(dǎo)分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基+專用血清,成骨誘導(dǎo)液為：雙抗、200μmol/L抗壞血酸、10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉和0.1μmol/L地塞米松。對照組培養(yǎng)液換為L-DMEM添加10％FBS,細胞置入37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),每兩

4、天換液1次,連續(xù)培養(yǎng)3周。分別在第1、2、3周結(jié)束誘導(dǎo)結(jié)束時，通過檢測ALP活性、膠原表達情況、以及鈣結(jié)節(jié)表達情況，觀察成骨誘導(dǎo)的效果；分組方法同上，取第2代MenSCs,按5×104/mL接種于被明膠包被的6孔板中,細胞過夜貼壁后誘導(dǎo)組更換為干細胞成脂誘導(dǎo)分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基+專用血清,1×10-6mol/L地塞米松,10mol/L胰島素,0.5mmol/L IBMX,0.2mmol/L吲哚美辛,對照組培養(yǎng)液L-DMEM添加10% FBS,

5、細胞置入37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),每兩天換液1次。分別在誘導(dǎo)2、3、4周結(jié)束時,進行油紅O染色，鏡下觀察油紅染色的結(jié)果。通過檢測MenSCs成骨成脂的誘導(dǎo)情況。探討其在體外向成骨成脂方向分化的潛能。將培養(yǎng)后的MenSCs分為4個研究組，每組培養(yǎng)體系中添加生長因子(TGF-β10ng/ml。EGF10ng/ml。PDGF-BB10ng/ml)和不同濃度17-β-雌二醇(1×10-9 mol/L、1×10-8 mol/L、1

6、×10-7 mol/L、1×10-6mol/L),分別標記為組1、組2、組3、組4，培養(yǎng)體系中未添加生長因子和雌激素的組為對照組。誘導(dǎo)培養(yǎng)5天后觀察細胞形態(tài)學(xué)變化及應(yīng)用免疫細胞化學(xué)法檢測人子宮內(nèi)膜上皮細胞標記物角蛋白（cytokeratin，CK）和基質(zhì)細胞標記物波形蛋白（Vimentin，VIM），同時運用RT-PCR和Westernblot檢測CK、VIM mRNA表達水平及蛋白表達的量，以進一步驗證MenSCs是否向子宮內(nèi)膜方向分

7、化及不同雌激素濃度對分化過程的影響。
　　結(jié)果:本實驗表明利用 Ficoll離心法能從健康女性月經(jīng)血中分離并培養(yǎng)出干細胞，此原代細胞約1.5周達到85%~90%融合，細胞多成梭形、漩渦狀、輻射狀。MTT法得出細胞倍增時間約為30~32h。此細胞傳代后能穩(wěn)定生長，可見細胞形態(tài)以纖維樣為主導(dǎo)。發(fā)現(xiàn)傳代中，在接種細胞1~2天，細胞增殖緩慢，第3~4天全量換液后細胞生長迅速，進入對數(shù)生長期，接著5-6天后細胞生長較前緩慢，進入平臺期，整個

8、過程未出現(xiàn)抑制現(xiàn)象。用流式細胞儀術(shù)檢測結(jié)果顯示，此類細胞表面標記OCT-4、Strol-1、CD45、表達率分別為95.13%±0.81%，1.80%±0.92%，0.93%±0.42%。細胞表現(xiàn)出OCT-4強陽性，Strol-1、CD45陰性。此說明培養(yǎng)的細胞具有胚胎干細胞性質(zhì)。誘導(dǎo)分化實驗表明MenSCs成骨誘導(dǎo)前期誘導(dǎo)組細胞膠原表達量較后期升高,MenSCs誘導(dǎo)兩周后經(jīng)茜素紅染色可見鈣結(jié)節(jié)明顯,誘導(dǎo)組細胞ALP(alkaline

9、phosphatase)活性-成骨細胞分化成熟的重要標志隨著誘導(dǎo)時間延長呈上升趨勢，強陽性，對照組陰性。經(jīng)成脂誘導(dǎo)3周,有明顯的脂滴出現(xiàn)，油紅O染色呈陽性，對照組陰性。體外向子宮內(nèi)膜細胞方向分化結(jié)果表明：各研究組 CK、VIM mRNA表達水平及蛋白表達量明顯高于對照組（p<0.05)；組2（1×10-8mol/L）CK mRNA表達水平最高與其他4組相比較(p<0.05，)，且CK mRNA表達量隨雌激素濃度增高略有下降；而VIM的m

10、RNA表達量相反，即隨著雌激素濃度增高 VIM mRNA表達的量增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。CK和 VIM蛋白相對表達量也顯示這一結(jié)果。證實MenSCs在體外細胞生長因子和雌激素刺激下能夠向子宮內(nèi)膜細胞方向分化，且雌激素濃度不同分化結(jié)果有差異。
　　結(jié)論:通過Ficoll密度梯度離心法能獲得MenSCs，流式細胞術(shù)檢測特定的細胞表面標志物也證實了其為經(jīng)血源性子宮內(nèi)膜干細胞，進一步的實驗也表明其能在體外誘導(dǎo)向成骨細胞和脂肪細胞方向分化