雌激素調(diào)節(jié)豬炎性子宮內(nèi)膜細(xì)胞的分子機(jī)制.pdf

1、母豬子宮內(nèi)膜炎是指母豬子宮黏膜的粘液性或化膿性炎癥，可造成母豬發(fā)情異常，是造成規(guī)?；B(yǎng)豬生產(chǎn)中母豬高淘汰率的最重要疾病之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失。有調(diào)查顯示，在養(yǎng)豬業(yè)中，患有子宮內(nèi)膜炎的分娩母豬高達(dá)20%。子宮內(nèi)膜炎主要由病毒、細(xì)菌及寄生蟲等引起。目前，對(duì)子宮內(nèi)膜炎的治療主要采用抗生素、中藥、生物制劑等進(jìn)行治療，雖然具有較好的效果，但是，以上治療方法并不能徹底治療該病，且存在一定的副作用，嚴(yán)重影響患畜病后的繁殖能力。因此，對(duì)于家畜子宮內(nèi)

2、膜炎，應(yīng)該防重于治，在弄清其發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)上，采取更加有效的防治手段，最終使該病得到有效控制。
　　雌激素主要成分是17β-雌二醇（17β-E2），子宮是雌激素作用的重要靶器官。研究表明，多種子宮疾病均與雌激素有密切聯(lián)系，雌激素分泌情況的異常通常會(huì)導(dǎo)致某些子宮疾病。國(guó)內(nèi)外研究證明，雌激素可以調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜炎。本實(shí)驗(yàn)利用體外培養(yǎng)的豬子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，探究17β-E2對(duì)母豬子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞炎性因子的調(diào)控機(jī)制。其主要目標(biāo)為：
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3、1）體外培養(yǎng)并純化豬子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞；
　?。?）建立在體外條件下豬子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的炎癥模型；
　?。?）探究17β-E2對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞NO、TNF-α、IL-1表達(dá)的調(diào)控作用；
　?。?）探究雌激素α受體拮抗劑在17β-E2調(diào)控子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞炎性因子表達(dá)過程中的作用；
　?。?）探究JNK信號(hào)通路在17β-E2調(diào)控子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞炎性因子表達(dá)過程中的作用。
　　研究如下：
　?。?）實(shí)驗(yàn)選取

4、健康母豬正常子宮，將其子宮內(nèi)膜剝離，進(jìn)行原代培養(yǎng)、純化和傳代培養(yǎng)，最終獲得體外子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，經(jīng)過角蛋白免疫熒光染色鑒定，子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的純化率達(dá)95%以上，為后續(xù)研究提供了高純度、符合要求的細(xì)胞；
　?。?）為了探究制備豬子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞炎癥模型需要的LPS劑量，實(shí)驗(yàn)選取1μg/mL，10μg/mL，100μg/mL的脂多糖刺激體外培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞12h。通過MTT試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞的活性，并通過NO試劑盒、ELISA、RT

5、-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中NO、TNF-α、IL-1和NOS、TNF-α、IL-1的mRNA的表達(dá)量。結(jié)果顯示，10μg/mL的LPS能顯著提高子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的活性且能增加NO、TNF-α、IL-1和NOS、TNF-α、IL-1的mRNA的表達(dá)量，與對(duì)照組相比，差異顯著（P＜0.05）；LPS的濃度和炎性因子的分泌量呈劑量相關(guān)性，但由于100μg/mL的LPS顯著降低了細(xì)胞活性，因此后期實(shí)驗(yàn)選取10μg/mL的LPS對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)

6、胞進(jìn)行刺激，制作炎癥模型；
　?。?）為了探究17β-E2對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞炎性因子的影響，采用10μg/mL的LPS刺激子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞12h后，分別選取10-6M，10-7M，10-8M的17β-E2處理激發(fā)培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，通過NO試劑盒、熒光定量PCR和ELISA分別檢測(cè)在2h、6?h、12?h、24?h的NO、TNF-α、IL-1和NOS、TNF-α、IL-1的 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，三種濃度的17β-E2均

7、不同程度的降低了炎性因子的表達(dá)量，且這種降低程度與17β-E2的濃度呈正比。
　?。?）為了探究雌激素受體α在17β-E2調(diào)控子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞炎性因子中的作用，實(shí)驗(yàn)用10μg/mL LPS激發(fā)培養(yǎng)12h后，加入含濃度為10-6M17β-E2、10-6M17β-E2+三氧苯胺（TAM）的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h，通過NO試劑盒、ELISA、熒光定量PCR檢測(cè)NO、NOS、TNF-α、IL-1的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS+17β-E2組

8、炎性因子的分泌顯著降低，而LPS+17β-E2+TAM組炎性因子的分泌與LPS+17β-E2組差異顯著，與LPS組差異不顯著，表明雌激素受體α在17β-E2調(diào)節(jié)炎性因子表達(dá)過程中發(fā)揮了重要作用。
　　（5）為了了解JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在17β-E2對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞炎性因子調(diào)節(jié)過程中的作用，實(shí)驗(yàn)測(cè)定了LPS組、LPS+17β-E2組以及LPS+TAM+17β-E2的P-JNK和JNK蛋白的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)LPS組的P-JNK水平顯著提高，而

9、加入17β-E2后則顯著降低了P-JNK的表達(dá)水平，加入TAM后P-JNK的蛋白表達(dá)量比LPS+17β-E2組顯著提高，與LPS組無(wú)顯著差異。表明雌激素可能通過與雌激素受體α作用，抑制JNK路徑，從而抑制LPS刺激下的細(xì)胞因子的表達(dá)。
　　綜上所述，該實(shí)驗(yàn)可以得到以下結(jié)論：
　　1.本實(shí)驗(yàn)成功培養(yǎng)了豬子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞并建立了該細(xì)胞炎癥模型。
　　2.雌激素可抑制LPS引起的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的炎性因子的NO、TNF-α、