子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖中雌激素的非核效應(yīng)及其機制.pdf

1、第一部分
　　 目的：通過對子宮內(nèi)膜癌組織中Erα表達(dá)水平的檢測，探討其與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征之間的關(guān)系；通過檢測子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞表面Erα的表達(dá)及其受雌激素調(diào)控的研究，了解雌激素膜受體的在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中的表達(dá)，為后續(xù)雌激素非核效應(yīng)在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中的研究打下基礎(chǔ)。
　　 方法：采用免疫組織化學(xué)鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法(SABC)，對33例子宮內(nèi)膜癌組織標(biāo)本中Erα的蛋白表達(dá)及表達(dá)部位情況進(jìn)行檢測。通過半

2、定量積分綜合計量法分析結(jié)果。采用免疫熒光染色檢測子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株Ishikawa和HEC-1B細(xì)胞膜表面Erα的表達(dá)。用流式細(xì)胞儀計數(shù)和分析結(jié)果。
　　 結(jié)果：在子宮內(nèi)膜癌組織中，Erα的表達(dá)陽性率隨著臨床期別的增加而下降(p＝0.047)；隨著病理分級級別的增高而下降(p＝0.01)；隨著肌層浸潤的加深而下降(p＝0.033)。Erα在胞漿和胞膜上出現(xiàn)的比率也隨臨床期別、病理分級、肌層浸潤程度的增加而上升，但只在肌層浸潤的深淺

3、組別間有統(tǒng)計學(xué)差異(p＝0.024)。在Ishikawa細(xì)胞可以檢測到有3％的細(xì)胞膜表面存在Erα的表達(dá)，且受雌激素的調(diào)控，E2作用1小時后，膜上有熒光的細(xì)胞數(shù)量增加，但作用24小時后，帶有熒光的細(xì)胞數(shù)量則減少。E2-BSA作用下，則膜表面帶有熒光的細(xì)胞數(shù)量在1小時和24小時后持續(xù)增加。在HEC-1B細(xì)胞中檢測不到細(xì)胞膜表面的Erα表達(dá)。
　　 結(jié)論：Erα的表達(dá)隨著子宮內(nèi)膜癌病程的進(jìn)展而下降，Erα在細(xì)胞漿和細(xì)胞膜上的出現(xiàn)可能

4、與子宮內(nèi)膜癌的侵襲能力的增加有關(guān)。在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系Ishikawa細(xì)胞膜表面存在一小部分雌激素的胞膜受體，其表達(dá)受雌激素的調(diào)控。
　　 第二部分
　　 目的：檢測雌激素的非核效應(yīng)在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖中的作用，并通過研究各種抑制劑對雌激素的增殖作用的影響，探討雌激素非核效應(yīng)在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖中可能的作用途徑。
　　 方法：采用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)檢測不同濃度E2以及E2-BSA作用下子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株I

5、shikawa和HEC-1B的增殖情況，以及雌激素受體拮抗劑ICI 182780、MEK1抑制劑PD98059和HB-EGF中和抗體對雌激素促增殖作用的影響。
　　 結(jié)果：Ishikawa細(xì)胞在E2和E2-BSA達(dá)到1×10-8M以上濃度時才出現(xiàn)明顯的細(xì)胞增殖(p<0.05)；而在HEC-1B細(xì)胞中，E2則要達(dá)到1×10-7M濃度才能出現(xiàn)相同的增殖效應(yīng)(p<0.01)。ICI 180780和PD 98059都能夠顯著抑制E2和E

6、2-BSA在Ishikawa細(xì)胞中引發(fā)的細(xì)胞增殖作用(p<0.05)；HB-EGF中和抗體只對E2-BSA作用下Ishikawa細(xì)胞的增殖具有抑制效果(p<0.01)。在HEC-1B細(xì)胞中這三種抑制劑對雌激素誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖都沒有顯著作用。
　　 結(jié)論：不能通過細(xì)胞膜的E2-BSA具有與17β雌二醇同樣的促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa和HEC-1B增殖的作用。說明雌激素的非核效應(yīng)同樣也能引發(fā)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖活動。而這種雌激

7、素的促增殖效應(yīng)在Ishikawa細(xì)胞中能夠被雌激素受體的拮抗劑所阻斷，可以由此推測雌激素的核效應(yīng)和非核效應(yīng)促增殖的作用都是通過雌激素受體發(fā)揮的。PD 98059也能阻斷這一增殖效應(yīng)，提示MAPK信號通路可能在雌激素誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖中發(fā)揮著某種作用。HB-EGF中和抗體只對E2-BSA作用的Ishikawa細(xì)胞的增殖有抑制作用，提示HB-EGF可能是雌激素非核效應(yīng)在雌激素受體陽性子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中促進(jìn)細(xì)胞增殖效應(yīng)中的一環(huán)。
　　 第三

8、部分
　　 目的：通過檢測子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系Ishikawa和HEC-1B細(xì)胞在雌激素作用后細(xì)胞內(nèi)絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的活化、[Ca2+]I濃度的變化、以及分泌至細(xì)胞外的HB-EGF的含量的迅速改變，探討在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中，雌激素非核效應(yīng)的信號傳導(dǎo)途徑。
　　 方法：采用Western Blot方法檢測E2和E2-BSA分別作用后子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa和HEC-1B胞漿中ERK1/2的磷酸化程度，來反映M

9、APK通路的激活。利用光吸收指示劑法，在熒光共聚焦顯微鏡下動態(tài)觀測加入E2和E2-BSA后，子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。E2和E2-BSA分別作用于子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞15分鐘后，收集培養(yǎng)液上清，ELISA法檢測上清中HB-EGF的含量變化。同時檢測ICI 182780、PD 98059和HB-EGF中和抗體對這些信號分子改變的影響。
　　 結(jié)果：在Ishikawa細(xì)胞中ERK1/2的活化在E2和E2-BSA濃度為 1×10-8

10、M時最強，在HEC-1B細(xì)胞中則在E2為1×10-7M時，ERK1/2才出現(xiàn)明顯活化。在雌激素對MAPK活化的時效性研究中，E2以及E2-BSA的作用濃度為1×10-8M時，Ishikawa和HEC-1B細(xì)胞在2分鐘時就都出現(xiàn)了ERK1/2的磷酸化，分別在15分鐘和30分鐘達(dá)到峰值。當(dāng)對Ishikawa細(xì)胞給以ICI 182780預(yù)處理后，E2和E2-BSA對ERK1/2的活化作用被抑制；在用HB-EGF中和抗體處理過Ishikawa細(xì)

11、胞后，只有對E2-BSA作用后ERK1/2的磷酸化有抑制作用。而HEC-1B細(xì)胞中ERK1/2的活化則不受ICI 182780和HB-EGF中和抗體的影響。
　　 E2和E2-BSA都能促進(jìn)Ishikawa細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，ICI 182780能明顯抑制鈣離子的增加率。而在HEC-1B細(xì)胞中，也能見到E2和E2-BSA作用后胞內(nèi)鈣離子濃度的緩慢增加，但I(xiàn)CI 182780對其沒有抑制作用。
　　 在Ishikawa細(xì)胞的培

12、養(yǎng)上清中，只有E2-BSA作用組有HB-EGF的明顯增加(p<0.01),并且ICI 182780能夠抑制這種增加。而在HEC-1B細(xì)胞上清中則沒有HB-EGF含量的明顯改變。
　　 結(jié)論：能夠透膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的E2和不能透膜的E2-BSA都能夠引發(fā)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞內(nèi)ERK的快速磷酸化，以及細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，并且這種作用在Ishikawa細(xì)胞能夠被ER的拮抗劑ICI 182780所抑制，可以推測雌激素的這種非核效應(yīng)是由雌激素受體介導(dǎo)的