PTX對(duì)GPER介導(dǎo)的雌激素激活的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中PI3K-AKT信號(hào)通路的影響.pdf

1、背景與目的:
　　 子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率逐年上升。但子宮內(nèi)膜癌的臨床治愈率改善不明顯，尤其是晚期和復(fù)發(fā)患者的中位生存時(shí)間仍不足1年。子宮內(nèi)膜在缺乏孕激素對(duì)抗的高雌激素水平的長(zhǎng)期刺激下，可以發(fā)生異常增生并向惡性轉(zhuǎn)化，從而導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生，但目前雌激素導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制尚不完全明了。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，雌激素與其受體結(jié)合后在細(xì)胞核內(nèi)通過“轉(zhuǎn)錄效應(yīng)”發(fā)揮作用。然而，該作用模式并未能使子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌

2、等激素依賴性腫瘤得到有效的控制;除了經(jīng)典的“轉(zhuǎn)錄效應(yīng)”，雌激素還可以通過“非轉(zhuǎn)錄效應(yīng)”發(fā)揮作用。研究表明，雌激素還可以激活子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號(hào)通路，發(fā)揮“非轉(zhuǎn)錄效應(yīng)”促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)。那么，什么介導(dǎo)了雌激素的“非轉(zhuǎn)錄效應(yīng)”？最可能的候選分子是G蛋白偶聯(lián)雌激素受體(GPER)。本課題組的前期研究表明，GPER在雌激素受體(ER)高表達(dá)的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系Ishikawa細(xì)胞（ERα、ERβ均陽性

3、表達(dá)）和ER低表達(dá)的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系HEC-1A細(xì)胞（ERα陽性表達(dá)，ERβ陰性表達(dá)）中均有不同程度的表達(dá)，本研究通過應(yīng)用GPER阻斷劑——百日咳毒素(PTX)阻斷GPER的作用后，觀察其對(duì)Ishikawa和HEC-1A細(xì)胞中雌激素激活的Akt活化狀態(tài)的影響，以及細(xì)胞中GPER和ERα、ERβ蛋白表達(dá)的變化，以了解PTX對(duì)GPER介導(dǎo)的雌激素活化的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路的影響。
　　 材料與方法:
　　

4、 1.材料
　　 子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系Ishikawa及HEC-1A均由北京大學(xué)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室魏麗惠教授惠贈(zèng)。
　　 2.方法
　　 采用靜置貼壁體外培養(yǎng)法培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜癌HEC-1A及Ishikawa細(xì)胞;當(dāng)HEC-1A及Ishikawa細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，采用免疫組化SP法分別檢測(cè)兩種細(xì)胞系中GPER蛋白的表達(dá);將不同濃度(0、0.1、0.5、1.0μg/ml)的PTX分別處理HEC-1A及Ishik

5、awa細(xì)胞30min后;再予上述濃度的PTX分別聯(lián)合17β雌二醇(17β-E2;1×10-6mol/L)共同處理HEC-1A細(xì)胞15min、Ishikawa細(xì)胞30min，采用蛋白印記法檢測(cè)HEC-1A及Ishikawa細(xì)胞中GPER，ERα、ERβ蛋白的表達(dá)及AKT的活化狀態(tài)[AKT的活化狀態(tài)以磷酸化AKT(p-Akt)/Akt表示]。
　　 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

6、結(jié)果以（x）+s表示，經(jīng)過正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)后行方差分析，各組間的兩兩比較用Bonferroni法，P＜0.05為顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均重復(fù)3次。
　　 結(jié)果:
　　 1.免疫組化法檢測(cè)顯示，在Ishikawa和HEC-1A細(xì)胞中GPER蛋白均在細(xì)胞質(zhì)中呈棕黃色陽性表達(dá)。
　　 2.蛋白印跡法檢測(cè)顯示:不同濃度(0、0.1、0.5、1.0μg/ml)的PTX聯(lián)合17β-E2（1×10-6mol/L）處理后:

7、
　　 (1)在Ishikawa細(xì)胞中，p-Akt/Akt分別為0.74±0.54、0.34±0.06、0.18±0.03、0.07±0.15，GPER蛋白的表達(dá)水平分別為0.872±0.490、0.395±0.054、0.145±0.014、0.034±0.008，隨著PTX濃度的增加，p-Akt/Akt、GPER蛋白的表達(dá)水平均明顯下降(P＜0.05)，且當(dāng)PTX濃度為1.0μg/ml時(shí)下降最顯著（F=63.729，P=0.

8、0001;F=160.284，P=0.0001）;而ERα和ERβ蛋白的表達(dá)水平均無明顯變化（P＞0.05）。
　　 (2)在HEC-1A細(xì)胞中，p-Akt/Akt分別為0.73±0.09、0.26±0.14、0.11±0.03、0，GPER蛋白的表達(dá)水平分別為0.927±0.134、0.485±0.022、0.194±0.004、0，隨著PTX濃度的增加，p-Akt/Akt、GPER蛋白的表達(dá)水平均明顯下降（P＜0.05），且

9、當(dāng)PTX濃度為1.0μg/ml時(shí)均降至0（F=1039.321，P=0.0001;F=833.613，p=-0.0001）;而ERα蛋白的表達(dá)水平無明顯變化(P＞0.05)，ERβ蛋白呈陰性表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 在子宮內(nèi)膜癌HEC-1A和Ishikawa細(xì)胞中，PTX阻斷GPER后，可抑制雌激素對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路的活化作用。提示我們:GPER參與了雌激素對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路