毛囊干細胞的多分化潛能及其向汗腺細胞分化的實驗研究.pdf

1、干細胞(stem cells)維持著生命體組織器官的發(fā)生發(fā)展以及損傷的修復(fù)與再生，隨著近年來再生醫(yī)學的迅猛發(fā)展，干細胞治療在臨床中的應(yīng)用日益廣泛，療效顯著，已成為很多難治性疾病的終極治療手段，干細胞的研究已經(jīng)成為全國乃至全世界的研究熱點。在下文中我們將以毛囊干細胞這一成體干細胞為研究主體，對其生物學特性及其在再生醫(yī)學中的應(yīng)用進行研究實驗，以期證明毛囊干細胞為再生醫(yī)學干細胞治療的理想干細胞源。
　　目的:
　　1.體外分離培養(yǎng)

2、并擴增毛囊干細胞(hair follicle stem cells，HFSCs)，建立一種快速高效的細胞培養(yǎng)體系，為后續(xù)試驗奠定基礎(chǔ);
　　2.通過體外誘導(dǎo)實驗，將HFSCs定向誘導(dǎo)為皮脂腺細胞及表皮角質(zhì)形成細胞，驗證HFSCs的多分化潛能;
　　3.證實HFSCs經(jīng)過特殊共培養(yǎng)體系誘導(dǎo)后，可以分化為汗腺樣細胞(sweatgland cells，SGCs)，并可參與汗腺(sweat gland，SG)的修復(fù)與再生;
　

3、　4.以HFSCs為種子細胞構(gòu)建結(jié)構(gòu)和功能更趨于完整的組織工程全層皮膚。
　　方法:
　　1.分別用“酶消化-毛囊剝離-直接種植法”及“酶消化-毛囊剝離-酶消化”兩種方法體外分離HFSCs，并將毛囊組織或細胞植入鋪有Ⅳ型膠原，以絲裂霉素C處理過的成纖維細胞為飼養(yǎng)層的transwell雙層細胞培養(yǎng)板中，觀察對比兩組中細胞的形態(tài)、生長特性、及體外擴增能力的異同，并通過CD200、CD29、CK15等HFSCs特異性標記物的免疫細

4、胞化學染色、免疫細胞熒光染色及流式細胞技術(shù)，分析、鑒定分離培養(yǎng)的HFSCs;
　　2.分別建立兩種不同的體外細胞誘導(dǎo)體系，將HFSCs分別誘導(dǎo)分化為皮脂腺細胞、表皮細胞，并通過皮脂腺細胞及表皮細胞特異性標記物的免疫細胞化學、免疫細胞熒光染色及脂質(zhì)的油紅O染色，對誘導(dǎo)后細胞進行表型分析與鑒定;
　　3.體外分離培養(yǎng)人手掌或腳掌來源的SGCs及真皮間充質(zhì)干細胞(dermalmesenchymal stem cells，d-MSC

5、s)，利用transwell細胞培養(yǎng)板建立了一種特殊的HFSCs共培養(yǎng)體系，主要由熱休克的SGCs及一種仿真皮結(jié)構(gòu)的間質(zhì)組織構(gòu)成，我們又稱之為間質(zhì)飼養(yǎng)層(mesenchymal feeder layer，M-FL)主要包括:d-MSCs、Matrigel基質(zhì)膠以及一定比例的優(yōu)質(zhì)胎牛血清(FBS)，同時設(shè)立兩個對照組，對照組l中不包含熱休克SGCs，對照組2中不包含M-FL;細胞經(jīng)過誘導(dǎo)后，應(yīng)用免疫細胞化學，免疫細胞熒光染色及流式細胞技術(shù)

6、對誘導(dǎo)后細胞進行SGCs表型鑒定，對比實驗組、對照組1、對照組2中細胞的表型變化情況，同時，通過臺盼藍拒染實驗觀察各組細胞的生長活性，Edu(5'-ethynyl-2'-deoxyuridine)標記技術(shù)對比分析各組中細胞的增殖能力;
　　4.體外建立裸鼠腳掌燙傷模型，將HFSCs誘導(dǎo)來源的汗腺樣細胞（induced-sweat gland cells，i-SGCs）移植到裸鼠腳掌的燙傷部觀察，并以等量Nacl注射作為對照組，4周

7、后，愈合創(chuàng)面全層皮膚取材，汗腺特異性標記物癌胚抗原(carcino-embryonic antigen，CEA)、細胞角蛋白14(cytokeratin14，CK14)的免疫組化及免疫熒光染色分析判斷，觀察接受細胞移植的創(chuàng)面皮膚中是否有新生的汗腺結(jié)構(gòu)存在;
　　5.蛋白印跡法(western bolt)、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR

8、)及實時熒光定量PCR(real-time fluorescentquantitative PCR)檢測分析HFSCs誘導(dǎo)前、后的外胚層發(fā)育不良(ectodermaldysplasia，EDA)基因及其受體（ectodermal dysplasia receptor, EDAR）的基因及蛋白表達的變化，以進一步探索HFSCs分化為SGCs的分子機制;
　　6.分別以HFSCs（A組），表皮干細胞(epidermal stem ce

9、lls，ESCs)(B組)為種子細胞體外建立組織工程學全層皮膚，通過伊紅-蘇木素(hematoxylin-eosinstaining，HE)染色分析兩組標本形態(tài)結(jié)構(gòu)的異同，觀察A組標本中是否有毛囊樣結(jié)構(gòu)形成;兩組標本分別進行integrinβ1(CD29)、細胞角蛋白19(cytokeratin19，CK19)免疫組織化學染色，觀察陽性細胞分布多少及分布區(qū)域。
　　結(jié)果:
　　1.“酶消化-毛囊剝離-直接種植法”及“酶消化-

10、毛囊剝離-酶消化”兩種細胞分離方法對比結(jié)果顯示:應(yīng)用前一種方法培養(yǎng)的第一代細胞生長至80-90％融合的時間為13～14天，而后一種方法為8～9天，但是傳代后，從第二代細胞開始，兩組細胞的生長速度及增殖能力無明顯差異，無統(tǒng)計學意義(p＞0.05);
　　2.經(jīng)過特異性微環(huán)境的誘導(dǎo)，HFSCs分別被誘導(dǎo)分化為上皮膜抗原(EMA)及油紅染色陽性的皮脂腺細胞，以及細胞角蛋白10(cytokeratin10，CK10)陽性的角質(zhì)形成細胞;<

11、br>　　3.在HFSCs汗腺化誘導(dǎo)實驗中，實驗組中，有一部分HFSCs最終被定向誘導(dǎo)分化成為具有汗腺表型的細胞，對比之下，對照組1中沒有細胞分化為SGCs.對照組2中只有極少部分細胞發(fā)生了向SGCs的轉(zhuǎn)化;我們利用細胞的特異性標記物，通過免疫熒光染色及流式細胞技術(shù)鑒定誘導(dǎo)后細胞，發(fā)現(xiàn)在這些細胞中HFSCs特異性標記物CD200、CD29及CK15的表達變?nèi)趿?，而汗腺細胞特異性標記物CEA和CK14的表達卻增強了，這說明HFSCs在設(shè)計

12、的共培養(yǎng)微環(huán)境中可以實現(xiàn)向SGCs的分化;
　　4.western blot結(jié)果顯示分化而來的SGCs高表達EDA和EDAR，RT-PCR及實時熒光定量PCR分析顯示EDA基因及EDAR基因在誘導(dǎo)后SGCs中呈高表達狀態(tài);而CD29、CD200等HFSCs特異性抗原基因在汗腺化誘導(dǎo)后表達降低;
　　5.在隨后的細胞移植實驗中，接受了細胞注射的裸鼠燙傷腳掌的愈合創(chuàng)面，我們發(fā)現(xiàn)了類似SG的新生結(jié)構(gòu)，進而行SGCs特異性標記物的免

13、疫組織化學染色及免疫熒光染色，結(jié)果顯示這些類似汗腺的結(jié)構(gòu)對CEA、CK14呈陽性表達，而在Nacl注射組的創(chuàng)面標本中，沒有發(fā)現(xiàn)這種類汗腺結(jié)構(gòu)的存在。
　　6.在以HFSCs為種子細胞的A組及以ESCs為種子細胞的B組標本中，HE染色結(jié)果顯示，兩組標本均由表皮和真皮組成，二者之間以基底層相連接，基底層細胞排列較為整齊，細胞偏大，有CK19+和CD29+細胞散在分布;兩組間標本對比顯示:A組標本中，表皮層相對于B組較厚，分層較多，而且

14、部分標本在基底層下方有毛囊樣結(jié)構(gòu)形成，表皮與真皮結(jié)合較緊密;B組標本對比A組來說，表皮層較薄，分層較少，表皮真皮易分離，基底層附近CK19+和CD29+陽性細胞較A組標本少，基底層下淺真皮層中無毛囊樣結(jié)構(gòu)形成。
　　結(jié)論:
　　1.HFSCs可以在體外適宜的微環(huán)境中被分離、培養(yǎng)、擴增;其中“酶消化-毛囊剝離-酶消化”法較“酶消化-毛囊剝離-直接種植”法縮短了原代細胞的培養(yǎng)時間，在實驗中更具優(yōu)勢;
　　2.HFSCs具有

15、多分化潛能，可以在體外被誘導(dǎo)分化為皮脂腺細胞及表皮角質(zhì)形成細胞;
　　3.HFSCs可以在適宜的微環(huán)境中，被誘導(dǎo)分化為SGCs; HFSCs作為一種成體干細胞，有用于治療汗腺缺失的潛能;我們建立的共培養(yǎng)誘導(dǎo)體系可以有效的將HFSCs定向誘導(dǎo)分化為SGCs，其分子機制與EDA/EDAR基因的激活有關(guān);誘導(dǎo)分化而來的汗腺細胞是有功能的，可以參與皮膚創(chuàng)面中汗腺的再生;
　　4.以HFSCs為種子細胞有望構(gòu)建出富含皮膚附屬器的，形態(tài)