體外誘導(dǎo)毛囊Bulge細(xì)胞向皮脂腺細(xì)胞定向分化的研究.pdf

1、毛囊是皮膚重要的附屬器官，具有周期性生長的特點(diǎn)。目前已知毛囊干細(xì)胞位于外根鞘的隆突(bulge)區(qū)，研究證明毛囊bulge細(xì)胞具有多向分化的能力，不僅能分化形成毛囊，還能夠形成皮脂腺和表皮角朊細(xì)胞。由于表皮、毛囊和皮脂腺關(guān)系密切，一般將三者統(tǒng)歸為表皮-毛囊-皮脂腺單位(epidermo-piosebaceousunit)或表皮和毛囊皮脂腺單位(piosebaceousunit)。 皮脂腺(sebaceousgland)是皮膚重要

2、的附屬結(jié)構(gòu)，具有抗炎、抵抗外來微生物的作用；它能夠抗氧化，特別是抗紫外線的侵襲，對保持皮膚的完整和功能正常有著重要的作用。皮脂腺細(xì)胞的發(fā)育分化過程十分復(fù)雜，包括細(xì)胞形態(tài)的改變和基因表達(dá)的變化。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisomeproliferator-activatedreceptor，PPA腳)在成脂細(xì)胞分化過程中起著關(guān)鍵的作用，它能有效促進(jìn)脂質(zhì)合成。在PPARγ的三種亞型中，PPARγ2與脂肪和皮脂腺細(xì)胞的分化尤其相

3、關(guān)。PPARγ2是脂肪細(xì)胞分化過程中重要的調(diào)節(jié)因子，它可促使成纖維細(xì)胞或骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化。 盡管多項(xiàng)證據(jù)表明皮脂腺的更新和維持來源于毛囊的Bulge細(xì)胞，但是，至今仍未在體外實(shí)驗(yàn)中觀察到bulge細(xì)胞分化為皮脂腺細(xì)胞的直接證據(jù)。毛囊干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)技術(shù)的相對滯后，影響了研究的進(jìn)一步深入。我們在體外分離培養(yǎng)了毛囊bulge細(xì)胞，并在一定的條件下誘導(dǎo)bulge細(xì)胞向皮脂腺細(xì)胞定向分化，同時(shí)構(gòu)建PPARγ2質(zhì)粒，通過脂

4、質(zhì)體將其轉(zhuǎn)染到bulge細(xì)胞中，觀察它對bulge細(xì)胞定向分化為皮脂腺過程中的作用。主要結(jié)果如下： 1、毛囊bulge細(xì)胞的分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性的研究 采用免疫組化及原位雜交技術(shù)，檢測大鼠毛囊Bulge區(qū)細(xì)胞干細(xì)胞表面標(biāo)志物和分化標(biāo)志物的表達(dá)情況，運(yùn)用顯微分離及酶消化法分離并培養(yǎng)大鼠毛囊Bulge細(xì)胞，觀察培養(yǎng)的毛囊bulge細(xì)胞體外生長特性，同時(shí)比較了不同培養(yǎng)體系對bulge細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)干細(xì)胞

5、表面標(biāo)志物K19的表達(dá)主要位于毛囊的Bulge區(qū)，而該區(qū)不表達(dá)毛囊上皮的細(xì)胞分化標(biāo)志K10。(2)經(jīng)酶消化后的毛囊Bulge區(qū)組織易貼壁，24h后即有細(xì)胞爬出，沿Bulge區(qū)向外擴(kuò)展生長，3-4天后細(xì)胞出現(xiàn)融合，細(xì)胞在培養(yǎng)6～7天細(xì)胞數(shù)量達(dá)峰值，以后細(xì)胞生長減慢，傳代后細(xì)胞成克隆生長，生長良好，細(xì)胞形態(tài)均一，呈鋪路石狀，核漿比例大，表現(xiàn)出原始細(xì)胞形態(tài)的特征。(3)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測，群集生長的毛囊Bulge細(xì)胞表達(dá)K19，運(yùn)用免疫熒光雙標(biāo)

6、方法檢測細(xì)胞α6整聯(lián)蛋白和CD71的表達(dá)，該干細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)α6整聯(lián)蛋白，而CD71表達(dá)較弱。傳代后及隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞的K19陽性表達(dá)逐漸減弱，陽性細(xì)胞逐漸減少。(4)觀察第一代無血清KSFM培養(yǎng)基中的bulge細(xì)胞的生長曲線與含血清的DMEM培養(yǎng)基無明顯差異，但是比較不同代次間bulge細(xì)胞克隆形成率和K19陽性率，無血清KSFM組明顯優(yōu)于含血清的DMEM組。因此，對比傳統(tǒng)的培養(yǎng)體系，本實(shí)驗(yàn)采用低鈣無血清培養(yǎng)體系對保持bulge細(xì)

7、胞的生物學(xué)特性更為有效。 2、體外誘導(dǎo)毛囊bulge細(xì)胞向皮脂腺定向分化的初步研究 本部分我們觀察了大鼠毛囊bulge細(xì)胞在體外誘導(dǎo)環(huán)境下向皮脂腺細(xì)胞定向分化的能力，體外分離培養(yǎng)大鼠毛囊bulge細(xì)胞，然后在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞的分化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)光鏡下可以觀察到，bulge細(xì)胞開始培養(yǎng)時(shí)體積小、核大，核仁明顯，細(xì)胞器少，呈現(xiàn)典型的原始細(xì)胞形態(tài)。隨后細(xì)胞逐漸出現(xiàn)分化，胞體增大，細(xì)胞略呈圓形，胞漿豐富，胞漿與

8、核的比例增大。進(jìn)一步培養(yǎng)，可見一些細(xì)胞的核周圍內(nèi)有少量脂滴合成。誘導(dǎo)培養(yǎng)3周左右，核周的脂滴逐漸增多，形態(tài)類皮脂腺細(xì)胞結(jié)構(gòu)。同期培養(yǎng)的毛囊bulge細(xì)胞未出現(xiàn)此現(xiàn)象。(2)光鏡下觀察，誘導(dǎo)三周后毛囊bulge油紅O染色陽性，可以見到脂滴為鮮紅色，排列于胞核周圍，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測誘導(dǎo)后細(xì)胞表達(dá)EMA。(3)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果顯示，經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)的毛囊bulge細(xì)胞表達(dá)PPARγ蛋白，陽性信號為棕黃色，主要位于胞漿，同期培養(yǎng)的毛囊bulge

9、細(xì)胞表達(dá)弱陽性。 3、PPARγ2載體的構(gòu)建及GFP標(biāo)記在毛囊bulge細(xì)胞中表達(dá) 用基因克隆方法，成功構(gòu)建了pEGFP-PPARγ2真核表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)染毛囊bulge細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)倒置顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光，為下一步實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。(2)免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞表達(dá)PPARγ蛋白，陽性信號為棕黃色，主要位于胞漿。 4、PPARγ2促毛囊bulge細(xì)胞向皮脂腺細(xì)胞定向分化

10、 本部分采用免疫組化、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、RT-PCR及油紅O染色等方法觀察了PPARγ2對毛囊bulge細(xì)胞向皮脂腺分化的影響。結(jié)果如下：(1)免疫組化結(jié)果顯示，PPARγ在成人全毛囊中均有表達(dá)，其中毛囊內(nèi)根鞘、皮脂腺陽性最強(qiáng)，bulge區(qū)也有表達(dá)，但是信號較弱。在大鼠中主要表達(dá)于毛囊內(nèi)根鞘和皮脂腺，在bulge上部靠近皮脂腺區(qū)也有表達(dá)。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的毛囊bulge細(xì)胞弱表達(dá)PPARγ。(2)光鏡下可以觀察到，bulge-P

11、PARγ2細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)3周左右，核周的脂滴逐漸增多，形態(tài)類皮脂腺細(xì)胞結(jié)構(gòu)，油紅O染色示脂滴為鮮紅色，集中于胞核周細(xì)胞表達(dá)皮脂腺的標(biāo)志EMA，陽性信號為棕色，主要位于胞漿。bulge-mock細(xì)胞形態(tài)和實(shí)驗(yàn)組類似但未見脂滴的合成。(3)bulge-PPARγ2的油紅O染色陽性率明顯高于未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組細(xì)胞，雖然EMA陽性率差別不如油紅O陽性率明顯，但可以看到轉(zhuǎn)染PPARγ2質(zhì)粒組細(xì)胞的陽性強(qiáng)度高于未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組細(xì)胞。(4)我們檢測了PPARγ2