基底膜及其主要成分-Ⅳ型膠原對表皮角質(zhì)形成細胞分化的影響.pdf

1、目的：
　　探討正常皮膚與瘢痕皮膚在組織結(jié)構(gòu)學(xué)與細胞學(xué)中的差異，分析差異產(chǎn)生的原因，發(fā)現(xiàn)瘢痕組織的分化狀態(tài)可能是由于缺少正常基底膜所致。使用基底膜主要組成成分Ⅳ型膠原鋪板離體培養(yǎng)表皮干細胞，分析其在增殖分化過程中與空白對照組表皮干細胞在生物學(xué)特性等方面的異同點，驗證基底膜及其主要組成成分Ⅳ型膠原是否在抑制表皮干細胞分化過程中起重要作用。
　　方法：
　　采用HE染色法認識正常皮膚與瘢痕皮膚結(jié)構(gòu)，基底膜六胺銀染色法分析對

2、比正常皮膚與瘢痕皮膚基底膜結(jié)構(gòu)差異，組織間接免疫熒光法探尋正常皮膚與瘢痕中的表皮角質(zhì)形成細胞定位，分析不同分化階段的表皮角質(zhì)形成細胞在正常皮膚與瘢痕皮膚中分布與遷移規(guī)律差異。采用改良的Ⅳ型膠原鋪板選擇黏附法分離培養(yǎng)人ESCs，觀察其形態(tài)及增值分化的特點，并進行細胞間接免疫熒光鑒定。同時，繼續(xù)以Ⅳ型膠原鋪板作為實驗組，以不鋪Ⅳ型膠原做為對照組，采用高鈣離子濃度(1.5mM)培養(yǎng)基培養(yǎng)表皮干細胞，以高鈣刺激時間長短不同制造不同分化程度細胞模

3、型。用Western blot及RT-PCR技術(shù)研究表皮角質(zhì)形成細胞在不同處理因素下的表型變化，探討基底膜及其主要組成成分Ⅳ型膠原在表皮角質(zhì)形成細胞分化“命運”中的影響作用。
　　結(jié)果：
　　在體研究中發(fā)現(xiàn)正常皮膚中角質(zhì)形成細胞在從基底層經(jīng)棘層和顆粒層到角質(zhì)層的分化及向上遷移過程中，經(jīng)歷了有序的成熟模式，這一過程與基底膜的正常結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)。而瘢痕組織由于缺少了基底膜成分，細胞分化狀態(tài)紊亂，提前進入分化過程。采用改良的Ⅳ

4、型膠原差速黏附法能夠高效的分離表皮中的干細胞，分選出的細胞具有干細胞的形態(tài)特點且表達CK19、β1整合素；在高鈣離子濃度(1.5mM)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)下，兩組細胞均隨刺激時間延長體積變大，折光性變?nèi)酰藵{比變小，進而出現(xiàn)聚集分層現(xiàn)象，而經(jīng)過同時長高鈣離子培養(yǎng)基刺激的兩組細胞，鋪了Ⅳ型膠原的實驗組細胞相較對照組體積小，細胞聚集及分層現(xiàn)象均出現(xiàn)較遲，形態(tài)學(xué)上更趨近于未分化特性。RT-PCR和Western-blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ⅳ型膠原黏附培養(yǎng)

5、表皮干細胞后，實驗組細胞中CK19的表達較對照組增強，同時做為短暫擴充細胞標志的CK14以及作為終末分化細胞標志的CK10，在無Ⅳ型膠原鋪板組中的表達明顯高于膠原組，同樣再次支持了Ⅳ型膠原抑制表皮細胞分化的現(xiàn)象。
　　結(jié)論：
　　ESCs并非真正靜止的未分化細胞，而是一種已經(jīng)進入分化狀態(tài)但是仍具有多向分化潛能的干細胞，其增殖分化行為不但受到自身程序化基因表達的影響，同時又受到其所處的微環(huán)境-基底膜及其成分的調(diào)控。Ⅳ型膠原能夠