肝癌細胞在基底膜成分趨化作用下偽足形成的動力學行為研究.pdf

1、本文應用生物力學、細胞生物學、分子免疫學等方法和技術，以肝實質(zhì)細胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)細胞為研究對象，繼承本院在肝膽流變學領域的研究特色，參照Dong等方法，研究腫瘤細胞在基底膜成分趨化作用下偽足形成的動力學機理。本研究方法具有直觀、精細，易定量的特點；建立的雙微吸管趨化實驗方法，實現(xiàn)了同一細胞上偽足形成的嚴格對比研究。同時所建立的實驗方法還為癌轉(zhuǎn)移研究和抗癌轉(zhuǎn)移藥物抗趨化特性的評價提供了可靠的單

2、細胞研究方法。 本課題的主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下： (1)用單微吸管法對肝癌細胞在Ⅳ型膠原(typeⅣcollagen，ColⅣ)、層粘連蛋白(laminin，LN)趨化作用下偽足生長的動態(tài)過程，同時考察了肝癌細胞偽足的形成分別對趨化液中ColⅣ和LN濃度的依賴性。隨著ColⅣ趨化劑濃度的增加(100μg/ml～400μg/ml)，HCC細胞的偽足長度增加；當ColⅣ濃度≥400μg/ml時，細胞偽足的長度基本不變。隨著L

3、N趨化劑濃度的增加(50μg/ml～200μg/ml)，HCC細胞的偽足長度增加；當LN濃度≥200μg/ml時，細胞偽足的長度基本不變。 (2)應用雙微管法研究濃度不對稱趨化實驗中雙側(cè)偽足形成的相互影響和趨化劑種類不同時趨化性偽足形成的強度。實驗結(jié)果表明：固定單側(cè)微吸管濃度，濃度高的一側(cè)細胞偽足長度高于濃度低的一側(cè)；雙側(cè)偽足一側(cè)因趨化濃度下降而偽足生成減弱可使另一側(cè)偽足生成增強。比較趨化劑種類不同而濃度相同時，即雙側(cè)微吸管中一

4、側(cè)充滿200μg/mlColⅣ，而另一側(cè)為200μg/mlLN，LN的趨化性偽足生長速率比ColⅣ更快，且偽足的峰值更大。 (3)FACS對HCC細胞表面整合素表達的分析。對選定的HCC細胞株(7721)表面進行整合素α1、α2、α3、α4、α5、α6、β1亞單位表達率的測定。結(jié)果顯示：對選定的細胞株，整合素α1、α3、β1呈強表達，其表達率分別為95.07％，95.55％，95.78％；α5表達率為34％[58]；而α2、α4

5、、α6呈弱表達，其表達率分別為23.17％，2.47％，14.29％。 (4)為了討論整合素阻斷對HCC細胞趨化性偽足形成的影響，將整合素抗體加入充滿趨化劑的單微吸管中，動態(tài)觀察整合素阻斷對趨化性偽足形成的影響。為進一步研究整合素阻斷對細胞兩側(cè)偽足形成的相互影響上，采用一種相互對稱性雙微吸管法，即細胞兩側(cè)微吸管中趨化劑種類及濃度相同，于一側(cè)微吸管內(nèi)加入單克隆抗體anti-αn(n=1-6)和anti-β1研究細胞表面整合素阻斷對

6、雙側(cè)偽足形成平衡的影響。結(jié)果表明：通過整合素阻斷實驗，Anti-α2、Anti-α3、Anti-β1對肝癌細胞在ColⅣ趨化運動時偽足的生長有較強的抑制作用(P＜0.01)，表明HCC細胞在體外Ⅳ膠原環(huán)境下，主要通過α2β1、α3β1受體的影響HCC細胞的趨化偽足形成；同時，Anti-α3、Anti-α6、Anti-β1對肝癌細胞在LN趨化運動時偽足的生長有較強的抑制作用(P＜0.01)，HCC細胞在體外LN環(huán)境下，主要通過α3β1和α

7、6β1受體的影響HCC細胞的趨化性偽足形成。 (5)整合素阻斷對HCC與ColⅣ裱襯表面粘附力的影響 i.未加入抗體的控制組裱襯濃度的選擇：本研究ColⅣ濃度選為5μg/ml，其粘附力為952±134(×10-10N，n=60)。 ii.依次加入不同濃度的單克隆抗體，考察整合素阻斷對HCC細胞與ColⅣ裱襯表面粘附力的影響。結(jié)果表明：與控制組比較，HCC細胞與ColⅣ的粘附加入單抗體后，anti-α1幾乎對粘附無

8、影響；anti-α5影響較?。籥nti-α6對粘附的抑制作用最大，其次為anti-α4、anti-β1、anti-α3、anti-α2。說明在肝癌細胞與Ⅳ型膠原裱襯表面粘附過程中，整合素α2、α3、α4、α6、β1對肝癌細胞的粘附過程有影響，而α5影響較小，α1幾乎對粘附無影響。 (6)BoydenChamber研究整合素阻斷對群體細胞趨化性遷移運動的影響 采用Boyden小室法，考察肝癌細胞整合素阻斷對細胞分別向Col

9、Ⅳ和LN趨化遷移運動的影響。對Ⅳ型膠原而言，與控制組比較(未經(jīng)整合素阻斷的細胞)，加入anti-α1幾乎對HCC細胞的趨化性遷移無影響，而分別加入anti-α4、anti-α5、anti-α2、anti-α3、anti-α6、anti-β1時，細胞的趨化性遷移受到的抑制作用逐漸增加；對LN而言，與控制組比較(未經(jīng)整合素阻斷的細胞)，加入anti-α4、anti-α1幾乎對HCC細胞的趨化性遷移無影響，而分別加入anti-α2對肝癌細胞的

10、遷移抑制作用最強，其次是anti-α5、anti-β1、anti-α6、anti-α3對細胞的遷移有著不同程度的抑制。 (7)從FACS及Boyden小室和微吸管結(jié)果實驗研究HCC細胞趨化性遷移中相關的整合素分子與趨化性偽足形成和粘附相關的整合素分子的關系。 由微吸管實驗可見：肝癌細胞對Ⅳ型膠原趨化性偽足形成過程中，整合素亞單位α2、α3、β1為趨化性偽足形成的重要受體分子；從整合素阻斷研究考察HCC與ColⅣ膠原裱襯表

11、面粘附力的影響發(fā)現(xiàn)，整合素α2、α3、α4、α6、β1對肝癌細胞的粘附過程有影響，而α5影響相對較小，α1幾乎對粘附無影響。而Boyden小室對群體細胞趨化性遷移的研究表明：整合素α5、α2、α3、α6、β1細胞的趨化遷移的影響逐漸明顯，而α4影響較小。因此肝癌細胞趨化遷移過程中，整合素α2、α3、β1既對肝癌細胞的趨化偽足形成的受體，又是肝癌細胞的粘附受體；而整合素α6對肝癌細胞的粘附起作用；而α1對肝癌細胞與Ⅳ型膠原的趨化及粘附均影

12、響極小。將以上三種方法進行綜合考慮發(fā)現(xiàn)，HCC細胞向Ⅳ型膠原趨化性遷移相關的整合素分子基本上為偽足形成相關的整合素受體和粘附相關的受體總和，這提示細胞趨化遷移運動中偽足的形成和粘附介導的細胞體的遷移均有整合素分子的參與。 對LN而言，整合素α3、α6、β1為趨化性偽足形成的重要受體分子；而Boyden小室對群體細胞的研究表明：整合素α2、α5、β1、α6、α3對細胞的趨化遷移運動有影響，說明肝癌細胞遷移過程中，整合素α3、α6、