TNF-α對RANKL體外誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化的促進(jìn)作用及其機制探討.pdf

1、目的:破骨細(xì)胞是骨吸收的主要功能細(xì)胞，由造血系統(tǒng)的單核-巨噬細(xì)胞系分化而來，在生理和病理性骨代謝中發(fā)揮著重要的作用。許多疾病狀態(tài)下，破骨細(xì)胞的形成和功能受到影響，導(dǎo)致骨吸收異常的病理狀態(tài)。體內(nèi)破骨細(xì)胞分化是一個復(fù)雜的過程，其機制尚未完全明了。以刺激因子體外誘導(dǎo)骨髓單核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化是研究破骨細(xì)胞分化機制的有效方法，本實驗分離培養(yǎng)原代小鼠骨髓單核細(xì)胞，并以不同濃度刺激因子誘導(dǎo)，建立后續(xù)試驗應(yīng)用的小鼠原代骨髓單核細(xì)胞(BMMs)體外培養(yǎng)

2、體系。
　　 方法:取小鼠原代全骨髓細(xì)胞，在含有50ng/mlM-CSF的骨髓單核細(xì)胞培養(yǎng)基中37℃孵箱內(nèi)培養(yǎng)24h，利用差異貼壁方法去除骨髓基質(zhì)細(xì)胞，取未貼壁的細(xì)胞懸液，再利用單核細(xì)胞分離液分離出純度較高的骨髓單核細(xì)胞。以不同濃度RANKL體外誘導(dǎo)單核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化，于不同時間點觀察各組細(xì)胞分化狀態(tài)，培養(yǎng)72h時終止誘導(dǎo)，行TRAP染色，觀察比較誘導(dǎo)終點時不同濃度RANKL誘導(dǎo)組破骨細(xì)胞分化程度及破骨細(xì)胞計數(shù)。
　　

3、 結(jié)果:分離所得骨髓單核細(xì)胞呈貼壁生長，均勻分布，形態(tài)較為均一，多為圓形、多角形，少數(shù)為長梭形，細(xì)胞體積較小。本實驗采用50ng/mlM-CSF及兩種濃度小鼠重組RANKL分別誘導(dǎo):1ng/ml和10ng/ml。結(jié)果顯示，在誘導(dǎo)早期(24h)，兩組細(xì)胞生長狀態(tài)大致相同，形態(tài)較為均一，細(xì)胞多為圓形及多角形，少量單核細(xì)胞呈TRAP染色陽性，均未見多核細(xì)胞生成。兩組細(xì)胞均于誘導(dǎo)48h開始出現(xiàn)體積較小的TRAP陽性多核細(xì)胞，形態(tài)、體積及數(shù)目無

4、明顯差異。直至誘導(dǎo)晚期(72h)，兩組細(xì)胞分化狀態(tài)才出現(xiàn)區(qū)別:10ng/mlRANKL刺激組TRAP陽性多核細(xì)胞數(shù)量更多、體積更大，胞漿更為伸展;而1ng/mlRANKL刺激組TRAP陽性多核細(xì)胞體積則比較小，形狀多為毛刺狀或油煎蛋樣。
　　 結(jié)論:M-CSF的作用下全骨髓細(xì)胞于37℃孵箱內(nèi)培養(yǎng)24小時，此時收集未貼壁細(xì)胞，是利用BMMs在M-CSF作用下貼壁時間長于骨髓基質(zhì)細(xì)胞而進(jìn)行的第一次純化，將收集的未貼壁細(xì)胞經(jīng)過單核細(xì)胞

5、分離液梯度離心半小時，根據(jù)不同細(xì)胞密度的差異，取中間部分白膜層進(jìn)行單核細(xì)胞第二次純化，用此方法便可以分離出形態(tài)較為均一、純度較高的骨髓單核細(xì)胞，可用于后續(xù)試驗。在50ng/mlM-CSF條件下，高濃度(10ng/ml)RANKL較低濃度(1ng/ml)RANKL刺激組誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成能力更強，可以增加破骨細(xì)胞生成的數(shù)量、體積，并可能提高其骨吸收能力，但是并不能加快誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成的速度。后續(xù)試驗可選用1ng/mlRANKL及50ng/m

6、lM-CSF體外誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化。
　　 第二部分:TNF-α對體外誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的促進(jìn)作用及機制探討
　　 目的:骨穩(wěn)態(tài)一旦被破壞，便會導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生。骨吸收功能亢進(jìn)可導(dǎo)致骨質(zhì)破壞，骨密度降低，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松等，這些疾病大多伴隨有血清或骨關(guān)節(jié)局部腫瘤壞死因子(TNF-α)的增高。高水平TNF-α與全身或局部性骨丟失疾病的發(fā)生有著密切的關(guān)系，可直接或間接的促進(jìn)破骨細(xì)胞的生成及功能，但其具體

7、作用機制尚未完全闡明。近年來體外研究證明，TNF-α不直接影響RANK/RANKL近端激活的分子，而是可能通過活化破骨前體細(xì)胞內(nèi)鈣離子震蕩，增強NFATcl自放大作用來促進(jìn)RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成。體內(nèi)參與該震蕩調(diào)控的分子眾多，TNF-α是通過何種機制實現(xiàn)其對鈣離子震蕩的調(diào)控作用呢？以往文獻(xiàn)報道，ROS和PC-PLC是細(xì)胞內(nèi)位于多種TNF-α信號通路下游同時參與介導(dǎo)鈣振蕩形成的兩種重要信號分子，介導(dǎo)了細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)等多種細(xì)胞事件

8、的發(fā)生。IP3受體是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的一種鈣離子通道，通過結(jié)合IP3而活化，介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫和細(xì)胞質(zhì)之間的鈣離子交通，是細(xì)胞內(nèi)鈣震蕩波形成的重要通道。至今研究發(fā)現(xiàn)主要存在3種IP3受體亞型:IP3R1、IP3R2和IP3R3，其分布有組織和細(xì)胞類型特異性。研究顯示，小鼠破骨前體細(xì)胞中同時存在上述三種IP3受體。本部分實驗旨在探討ROS、PC-PLC及IP3Rs在TNF-α對鈣離子震蕩調(diào)控過程中的作用，進(jìn)一步揭示TNF-α促進(jìn)體內(nèi)外破骨細(xì)胞生

9、成的機制。
　　 方法:本研究采用第一部分實驗中建立的破骨細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，以1ng/mlRANKL和50ng/mlM-CSF誘導(dǎo)小鼠骨髓來源單核細(xì)胞，在誘導(dǎo)過程中加入3ng/mlTNF-α刺激。使用DCFH-CA熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)不同誘導(dǎo)時間點ROS水平變化，明確ROS在RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化過程中的變化趨勢及加入TNF-α刺激后細(xì)胞內(nèi)ROS的變化情況;采用磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C(PC-PLC)特異性抑制劑D609探討P

10、C-PLC在TNF-α促進(jìn)體外誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成中的作用。將培養(yǎng)細(xì)胞分為誘導(dǎo)對照組、TNF-α刺激組、D609刺激組及TNF-α+D609刺激組四組，施加不同誘導(dǎo)及刺激因子。于培養(yǎng)48h時，激光共聚焦顯微鏡檢測各刺激組細(xì)胞內(nèi)鈣離子的震蕩情況，明確各刺激因素對鈣振蕩的影響效果;RT-PCR及westernblotting檢測不同處理組三種IP3RsmRNA及蛋白表達(dá)水平，進(jìn)一步闡述IP3Rs在TNF-α促進(jìn)RANKL體外誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成過程

11、中的作用。
　　 結(jié)果:研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)ROS水平在RANKL誘導(dǎo)24h開始升高，并持續(xù)至48h以后，加入TNF-α不能使細(xì)胞內(nèi)ROS進(jìn)一步升高;比較各組TRAP染色陽性多核細(xì)胞數(shù)發(fā)現(xiàn)，磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C(PC-PLC)特異性抑制劑D609抑制了TNF-α對破骨細(xì)胞生成的促進(jìn)作用，但是對RANKL單獨誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成并無抑制，相反輕度促進(jìn)破骨細(xì)胞生成。TNF-α能夠明顯增強小鼠骨髓來源單核細(xì)胞中鈣離子通道IP3R1mR

12、NA和蛋白的表達(dá)，而不影響IP3R2和IP3R3mRNA水平，提示位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的鈣離子通道IP3R1的上調(diào)可能為其配體IP3提供更多的結(jié)合位點，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鈣震蕩的產(chǎn)生，IP3R1參與TNF-α對RANKL體外誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成的促進(jìn)作用，而IP3R2和IP3R3可能并不參與介導(dǎo)該過程。D609抑制了TNF-α對IP3R1mRNA和蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用，降低鈣離子震蕩水平，進(jìn)而抑制NFATc1活化，同時消除了TNF-α對破骨細(xì)胞生成的影響。

13、上述結(jié)果表明PC-PLC及IP3R1可能參與TNF-α促進(jìn)破骨細(xì)胞生成的過程之中。
　　 結(jié)論:本實驗結(jié)果進(jìn)一步驗證了TNF-α不直接影響RANK/RANKL近端激活的分子，ROS可能介導(dǎo)破骨細(xì)胞體外分化，但不參與TNF-α對RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成的促進(jìn)作用;TNF-α能夠通過活化PC-PLC，上調(diào)IP3RlmRNA和蛋白的表達(dá)水平，促進(jìn)破骨前體細(xì)胞內(nèi)鈣庫與細(xì)胞漿之間的鈣交通，以增強其鈣離子震蕩，促進(jìn)NFATc1活化和自放大