拉伸應(yīng)變對(duì)破骨細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景和目的
　　骨是人體重要的承重和運(yùn)動(dòng)器官,骨組織始終處于外界力學(xué)環(huán)境中。骨既能承受外界力學(xué)載荷,又能隨著外界力學(xué)載荷的變化改變自身的形態(tài)和功能。骨重建是成熟骨組織的一種重要替換機(jī)制。力學(xué)載荷是通過骨重建過程對(duì)骨的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。生理狀態(tài)下,骨吸收和骨形成之間形成一種動(dòng)態(tài)平衡,骨在功能需要的地方發(fā)生骨形成,在不需要的地方發(fā)生骨吸收。骨重建過程包括了破骨細(xì)胞的破骨作用和成骨細(xì)胞的成骨作用。破骨細(xì)胞是來源于骨髓造血干細(xì)胞

2、從單核巨噬細(xì)胞系早期的分化過程中分支出來。破骨細(xì)胞是骨重建的過程的直接參與者,并在骨重建的起始階段起到關(guān)鍵作用。破骨細(xì)胞的活性變化和凋亡變化都會(huì)對(duì)骨重建過程有重要影響。但是,力學(xué)載荷是否對(duì)破骨細(xì)胞凋亡起作用目前尚不清楚。
　　本研究試圖通過細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的方法來研究基底拉伸應(yīng)變對(duì)破骨細(xì)胞凋亡的影響,并初步探索基底拉伸應(yīng)變對(duì)破骨細(xì)胞凋亡影響的作用機(jī)制。
　　研究內(nèi)容
　　(1)破骨細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)及鑒定。
　

3、　(2)基底拉伸應(yīng)變對(duì)破骨細(xì)胞凋亡的影響的研究。
　　(3)基底拉伸應(yīng)變對(duì)破骨細(xì)胞凋亡影響的機(jī)制的初步研究。
　　研究方法
　　(1)利用來自小鼠的破骨前體細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞,采用含有兩種細(xì)胞因子濃度為50ng/mL的小鼠重組可溶性核因子кB受體活化因子配基(receptoractivatorofNF-кBligand,RANKL)和50ng/mL的巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage-colonysti

4、mulatingfactor,M-CSF)的DMEM(Dulbeccominimumessentialmedium)培養(yǎng)基,誘導(dǎo)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用的成熟破骨細(xì)胞。利用多種方法鑒定誘導(dǎo)的細(xì)胞是否具有成熟破骨細(xì)胞活性:首先采用光學(xué)顯微鏡下直接觀察和TRAP染色后觀察誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞,又采用了甲苯胺藍(lán)染色和掃描電子顯微鏡觀察破骨細(xì)胞形成的骨吸收陷窩的方法鑒定破骨細(xì)胞。
　　(2)對(duì)破骨細(xì)胞施加生理強(qiáng)度2500με和病理強(qiáng)度5000με的基底拉伸應(yīng)

5、變,加載條件采用連續(xù)3d,1次/d,每次1h,加載頻率為0.5HZ。檢測(cè)拉伸應(yīng)變是否對(duì)破骨細(xì)胞凋亡有影響:對(duì)加載后的破骨細(xì)胞采用hoechst染色,Annexin結(jié)合實(shí)驗(yàn),caspase-3活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)等方法檢測(cè)破骨細(xì)胞的凋亡情況。
　　(3)對(duì)破骨細(xì)胞施加生理強(qiáng)度2500με和病理強(qiáng)度5000με的基底拉伸應(yīng)變,加載條件采用1次/d,每次1h,連續(xù)3d,加載頻率為0.5HZ。檢測(cè)線粒體通路是否參與拉伸應(yīng)變對(duì)破骨細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)中:

6、對(duì)加載后的破骨細(xì)胞進(jìn)行JC-1染色,采用線粒體膜電位測(cè)定實(shí)驗(yàn)測(cè)定線粒體膜電位,免疫印跡實(shí)驗(yàn)測(cè)定破骨細(xì)胞Bcl-2、caspase-3的表達(dá)和細(xì)胞色素C的釋放。
　　研究結(jié)果
　　(1)誘導(dǎo)培養(yǎng)3d后,光學(xué)顯微鏡下有體積增大的多核細(xì)胞出現(xiàn),形態(tài)不規(guī)則并且邊緣模糊。誘導(dǎo)培養(yǎng)7d后,多核細(xì)胞體積進(jìn)一步增大,數(shù)量增多?？咕剖崴嵝粤姿崦?TRAP)染色多核巨細(xì)胞的胞核呈藍(lán)色,胞質(zhì)特異性染色呈紅色。
　　骨片骨吸收陷窩甲苯胺藍(lán)染

7、色結(jié)果顯示,骨片上有邊緣清晰的骨吸收陷窩形成,有骨吸收陷窩處因染料填入而呈甲苯胺藍(lán)濃染的藍(lán)紫色。掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示薄骨片上有明顯的骨吸收陷窩形成,邊緣清晰,內(nèi)部凹陷且底面凹凸不平。
　　(2)對(duì)破骨細(xì)胞施加基底拉伸應(yīng)變3d后,hoechst染色結(jié)果顯示,兩組加載組細(xì)胞和一組對(duì)照組細(xì)胞均有細(xì)胞凋亡發(fā)生,其中凋亡的多核破骨細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)色致密濃染的胞核。計(jì)數(shù)后得出三組破骨細(xì)胞的凋亡率,對(duì)照組破骨細(xì)胞的凋亡率為21.45％±0.99

8、%,2500με載荷加載組破骨細(xì)胞的凋亡率為15.34%±1.50%,與對(duì)照組相比顯著下降(p<0.05),5000με載荷加載組破骨細(xì)胞的凋亡率為21.95%±1.06%,與對(duì)照組相比無顯著差異(p>0.05)。
　　Annexin結(jié)合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,對(duì)照組破骨細(xì)胞的早期凋亡率為11.80%,2500με載荷加載組破骨細(xì)胞的早期凋亡率為7.54%,與對(duì)照組相比顯著下降,5000με載荷加載組破骨細(xì)胞的凋亡率為10.30%,與對(duì)照

9、組相比下降并不明顯。
　　最后,caspase-3活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,2500με載荷加載組相對(duì)對(duì)照組的caspase-3活性為0.7046±0.0148,與對(duì)照組相比顯著下降(p<0.05),5000με載荷加載組相對(duì)對(duì)照組的caspase-3活性為1.1244±0.0602,與對(duì)照組相比稍有上升(p<0.05)。
　　(3)對(duì)破骨細(xì)胞施加基底拉伸應(yīng)變3d后發(fā)現(xiàn),線粒體膜電位測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,2500με載

10、荷加載組破骨細(xì)胞的線粒體膜電位顯著增高(p<0.05),表明破骨細(xì)胞線粒體膜的去極化過程被阻止,5000με載荷加載組破骨細(xì)胞的線粒體膜電位與對(duì)照組相比無明顯差異(p>0.05)。
　　免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,2500με載荷加載組破骨細(xì)胞的Bcl-2表達(dá)明顯大幅度增高(p<0.05),5000με載荷加載組破骨細(xì)胞的Bcl-2表達(dá)同樣增高(p<0.05),但幅度并不沒有2500με載荷加載組的那么大。同時(shí),與對(duì)照組相

11、比,2500με載荷加載組破骨細(xì)胞的胞漿細(xì)胞色素C含量顯著減少(p<0.05),暗示細(xì)胞色素C的釋放被抑制,而5000με載荷加載組破骨細(xì)胞的胞漿細(xì)胞色素C含量與對(duì)照組相比并無明顯變化(p>0.05)。最后,2500με載荷加載組破骨細(xì)胞的caspase-3表達(dá)顯著減少(p<0.05),而5000με載荷加載組破骨細(xì)胞的caspase-3表達(dá)與對(duì)照組相比并無明顯變化(p>0.05)。
　　結(jié)論
　　(1)小鼠單核/巨噬細(xì)胞系

12、RAW264.7細(xì)胞在含有50ng/mL的RANKL和50ng/mL的M-CSF的DMEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)下,可以分化出具有典型生物學(xué)活性的成熟破骨細(xì)胞。
　　(2)拉伸應(yīng)變的加載能夠影響破骨細(xì)胞的凋亡。目前為止,未見此類相關(guān)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn),對(duì)破骨細(xì)胞施加2500με的四點(diǎn)彎曲基底拉伸應(yīng)變能夠明顯抑制破骨細(xì)胞的凋亡,而5000με的加載對(duì)破骨細(xì)胞凋亡的影響并不明顯。
　　(3)線粒體通路參與到破骨細(xì)胞凋亡的力學(xué)響應(yīng)過程中。同樣,