成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)及氟對其的影響.pdf

1、本文通過細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),研究氟對成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu),以及對成骨細(xì)胞體外增殖和礦化能力的影響.試驗采用24h內(nèi)昆明乳鼠,拉頸處死,無菌取出頭蓋骨,在超凈工作臺內(nèi)將其剪碎,先用0.25﹪胰蛋白酶37℃消化30min,然后用0.2﹪膠原酶37℃振蕩消化60min,反復(fù)吹打骨片分離更多細(xì)胞.用含15﹪胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液將細(xì)胞配成所需濃度進(jìn)行接種.培養(yǎng)第二天換液,以后隔天換液.采用此法成功分離培養(yǎng)出了具有典型特征的成骨細(xì)胞.培養(yǎng)過程中

2、,成骨細(xì)胞表現(xiàn)出不同的體外生長時相(潛伏期、對數(shù)生長期、水平靜至期),剛接種的成骨細(xì)胞呈球形,4h后部分細(xì)胞貼壁展開,24h后細(xì)胞完全貼壁展開.第3d時,成骨細(xì)胞呈半?yún)R合狀態(tài);5d時,細(xì)胞完全匯合;7d時,細(xì)胞重疊生長,呈鋪路石狀;9d時,成骨細(xì)胞密積生長;11d時,基質(zhì)堆積,細(xì)胞結(jié)節(jié)形成;13d時,礦化結(jié)節(jié)形成.氟對成骨細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、體外增殖能力的影響具有劑量-時間依賴性.大于10<'-4>mol/l的氟對成骨細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性作

3、用,10<'-1>mol/l和10<'-2>mol/l氟能致成骨細(xì)胞急性死亡.氟濃度小于10<'-4>mol/l時,對成骨細(xì)胞的毒性作用不明顯.10<'-5>mol/l~10<'-7>mol/l氟可促進(jìn)成骨細(xì)胞的體外增殖,10<'-3>mol/l和10<'-4>mol/l氟對成骨細(xì)胞的體外增殖具有抑制作用.氟對成骨細(xì)胞礦化能力的影響具有劑量依賴性.經(jīng)實驗觀察表明,10<'-5>mol/l~10<'-7>mol/l氟能促進(jìn)成骨細(xì)胞的礦化能

4、力.另外,試驗采用2周齡的昆明小鼠,拉頸處死,在超凈工作臺內(nèi)無菌分離長骨,剔除骨周組織和骨骺端.將分離骨骼置于冷DMEM培養(yǎng)液中,分成兩半,刮取骨髓,而后吹打骨碎片,使更多細(xì)胞脫落.待骨片沉淀后,將骨髓細(xì)胞接種,30min后收集未貼壁的細(xì)胞,重接種于成骨細(xì)胞上培養(yǎng),以后隔2d換液.用此法成功誘導(dǎo)培養(yǎng)出了具有多核、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)陽性的破骨細(xì)胞.氟對破骨細(xì)胞形態(tài)的影響呈劑量-時間依賴性.倒置相差顯微鏡下10<'-1>mol/