煙草浸提液對(duì)大鼠體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的影響

1、<p>　　煙草浸提液對(duì)大鼠體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的影響</p><p>　　作者：王桂龍 侯玉東 石玲波 </p><p>　　【摘要】 目的 探索煙草浸提液對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的附著和生長(zhǎng)的影響。方法 將周齡SD大鼠顱蓋骨，剪成1.5 mm×1.5 mm大小組織塊，先用0.25％胰蛋白酶消化20 min、0.1％Ⅱ型膠原酶消化30 min后，再對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察

2、細(xì)胞形態(tài)，并對(duì)其堿性磷酸酶(ALP)活性及礦化能力進(jìn)行鑒定。實(shí)驗(yàn)分對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組按所加煙草浸提液濃度的不同分為0.8、1.6、3.2、6.4、12.5、25和50 g／L 7個(gè)濃度組，分別測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。采用SPSS13.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行雙因素方差分析。結(jié)果 煙草浸體液對(duì)成骨細(xì)胞的附著和生長(zhǎng)起抑制作用，并隨其濃度的升高而增強(qiáng)。各處理組間存在顯著差異（P＜0.01）；各組內(nèi)的前3 d存在顯著性差異（P＜0.01），但

3、3.2～50 g／L組第4～7天間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 吸煙不利于口腔種植的臨床愈合。 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 成骨細(xì)胞；原代培養(yǎng)；SD大鼠；煙草浸提液 </p><p>　　【Abstract】 Objective To investigate the effects of smokeless tobacco extract(ST) on the

4、attachment and growth of the rat’s osteoblasts in vitro.Methods The bone tissues from the calvaria in rats aged 1 week were cut into blocks of 1.5 mm × 1.5 mm.They were digested by 0.25％ trypsinase for 20 minutes a

5、nd by 0.1％ collagenase II for 30 minutes and then the liquid supernatant was abandoned. The bone blocks were cultured to acquire isolated cells.The identification was conducted by cell morphology</p><p>　　【K

6、ey words】 osteoblast,primary culture,rats,smokeless tobacco extract </p><p>　　目前，口腔種植技術(shù)因其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)而獲得了臨床醫(yī)師及患者的青睞，而骨結(jié)合則是其成功的基礎(chǔ)。骨組織作為一種特殊的鈣化組織，主要由成骨細(xì)胞完成并受體內(nèi)多種因素調(diào)控。隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，成骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)成為可能。體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞可以排除體內(nèi)多種因素的相互影

7、響，從而為骨形成和代謝機(jī)理方面的研究提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目前成骨細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法主要有2種：酶消化法和組織塊法［1,2］。酶消化法雖可獲得大量細(xì)胞，但獲得的細(xì)胞不純。本實(shí)驗(yàn)擬采用酶消化后再對(duì)組織塊進(jìn)行培養(yǎng)的方法來獲得純度較高的成骨細(xì)胞，觀察煙草浸提液對(duì)成骨細(xì)胞的附著及生長(zhǎng)的影響，以期證明吸煙是影響口腔種植的不利因素之一。 </p><p><b>　　1 材料和方法 </b></

8、p><p>　　1.1 器材和試劑 </p><p>　　1.1.1 主要儀器設(shè)備和材料:超凈工作臺(tái) (蘇州集團(tuán)安泰公司)；CO2培養(yǎng)箱 (Heraeus)；熒光倒置顯微鏡 (日本OLYMLOS)；眼科手術(shù)器械（上海手術(shù)器械廠）；血球計(jì)數(shù)板（鎮(zhèn)江市丹徒科達(dá)醫(yī)療用品廠）；50 ml玻璃培養(yǎng)瓶（Costar）；離心機(jī)（雷動(dòng)爾LDZ52）；高糖DMEM（Ｇibco）；胰蛋白酶（Amresco）

9、；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所）；膠原酶（Invitrogen）；煙草（成品盒裝香煙，煙氣煙堿量1.2 mg，焦油量13 mg）；SD大鼠（煙臺(tái)綠葉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。 </p><p>　　1.1.2 主要試劑的配制:①含煙草浸提液培養(yǎng)液的配制［3］:稱取5 g成品盒裝香煙的煙絲，加入0.1 L的雙蒸水，在37℃ 孵育箱中浸泡48 h，過濾除菌，將此濃度定為50 g／L。用含15 ml／L胎牛血清的DM

10、EM培養(yǎng)液配制含煙草浸提液的培養(yǎng)液，其濃度分別為0.8、1.6、3.2、6.4、12.5、25和50 g／L 7個(gè)濃度組。②成骨細(xì)胞礦化培養(yǎng)液的配制:DMEM培養(yǎng)基中加入雙抗(含青霉素100 U/ml 、鏈霉素100 U/ml)、10%胎牛血清、Na2CO3。含礦化液的DMEM培養(yǎng)基中加入雙抗(含青霉素100 U/ml 、鏈霉素100 U/ml)、10%胎牛血清、Na2CO3、β甘油磷酸鈉1×10-2mol/L、維生素C 5

11、0 mg/ml、地塞米松1×10-7mol/L。孵育液含3%β甘油磷酸鈉5 ml，2%巴比妥鈉5 ml，2%硝酸鈣10 ml，2%MgSO4 5 ml，蒸餾水25 ml。 </p><p>　　1.2 實(shí)驗(yàn)方法 </p><p>　　1.2.1 大鼠成骨細(xì)胞的原代培養(yǎng)：周齡SD大鼠處死后用75％酒精浸泡5 min，倒置顯微鏡下取其顱頂骨，以無(wú)菌DHanks(含青霉素100

12、 U/ml 、鏈霉素100 U/ml)沖洗，刮去骨膜、剪去骨縫間結(jié)締組織，制成約1.5 mm×1.5 mm大小的碎塊，以DHanks液沖洗3次，加入0.25% 胰蛋白酶37℃下震蕩消化20 min，棄上清，0.1%的II型膠原酶消化30 min后棄上清；所得骨塊直接放入培養(yǎng)瓶中加入含20% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 </p><p>　　1.2.2 細(xì)胞

13、培養(yǎng)及傳代：在原代培養(yǎng)過程中，每3～4 d換液1次，細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底時(shí)開始傳代，傳代時(shí)用差速貼壁法進(jìn)行純化［4］。0.25% 胰蛋白酶37℃消化10 min左右，當(dāng)觀察到細(xì)胞形態(tài)變圓，且部分細(xì)胞已開始脫離瓶底時(shí)，終止消化，離心后加入培養(yǎng)液進(jìn)行傳代，每瓶細(xì)胞可傳代2～3瓶。傳代3～5次后，成骨細(xì)胞得到純化，用于實(shí)驗(yàn)。 </p><p>　　1.2.3 成骨細(xì)胞鑒定：①熒光倒置顯微鏡下對(duì)細(xì)胞形態(tài)的變化及生長(zhǎng)狀況每日進(jìn)行

14、觀察。②堿性磷酸酶組織化學(xué)染色(改良Gomori鈣鈷法) 將純化后的第2代細(xì)胞接種于蓋玻片上，接種密度為1×104 /cm2。待細(xì)胞長(zhǎng)至匯合后取出蓋玻片，以常規(guī)Gomori鈣鈷法染色。玻片無(wú)菌沖洗2次后用冷丙酮（4℃冰箱保存）固定細(xì)胞10 min，蒸餾水沖洗數(shù)次，放人孵育液中37℃孵育4～6 h，然后依次入2％硝酸鈷5 min，蒸餾水沖洗數(shù)次。1%硫化銨中浸2 min，自來水沖洗，自然晾干，甘油明膠封片。③將第4代成骨細(xì)胞接

15、種爬片，用含礦化液的培養(yǎng)基培養(yǎng)3周，在倒置顯微鏡下可見白色結(jié)節(jié)， PBS沖洗2次，95%乙醇固定10 min。再用PBS沖洗2次，0.1%茜素紅TrisHCl（pH　8.3）染色30 min，用PBS沖洗，晾干、封片。 </p><p>　　1.2.4 成骨細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定：取3瓶體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞，用適量0.25%的胰蛋白酶消化10 min，離心后加入25 ml培養(yǎng)基，吹打成細(xì)胞懸液后，計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)其濃度

16、為1.35×105/ml。取24孔培養(yǎng)板8塊，滴加細(xì)胞懸液入其內(nèi)，每孔0.1ml，培養(yǎng)10 h使成骨細(xì)胞能貼壁生長(zhǎng)，測(cè)其貼壁率。而后每塊培養(yǎng)板內(nèi)各孔分別加入含不同濃度煙草浸提液的培養(yǎng)基0.9 ml，每濃度組為3孔，細(xì)胞每3 d換液一次。從加入煙草浸提液始每24 h計(jì)數(shù)1次。 </p><p>　　1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行雙因素方差分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用 x±s表示

17、，P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 </p><p><b>　　2 結(jié)果 </b></p><p>　　2.1 成骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 酶消化后對(duì)組織塊繼續(xù)培養(yǎng)3天，倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)骨塊周圍有少量細(xì)胞長(zhǎng)出，靠近骨塊處圓形細(xì)胞多見，遠(yuǎn)離骨塊處體積較小的梭型細(xì)胞常見；5 d后觀察，細(xì)胞數(shù)量較多，呈梭形、三角形或不規(guī)則多邊形，分化成熟者可見有3～4個(gè)突起。傳代后細(xì)胞

18、以梭形、三角形為主，呈集落樣生長(zhǎng)趨勢(shì)，最終可連接成片，出現(xiàn)重疊生長(zhǎng)現(xiàn)象（圖1）。 </p><p>　　2.2 堿性磷酸酶（ALP）組織染色 ＡＬＰ組織染色（改良Gomori鈣鈷法）測(cè)定為陽(yáng)性，顯示成骨細(xì)胞呈黑灰色著色（圖2）。 </p><p>　　2.3 成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)茜素紅染色觀察 成骨細(xì)胞生長(zhǎng)融合成復(fù)層后，不經(jīng)傳代繼續(xù)培養(yǎng)，形成鈣化結(jié)節(jié)后行茜素紅染色，顯微鏡下黑色的結(jié)節(jié)染

19、成紅色 (圖3)。 </p><p>　　2.4 煙草浸體液對(duì)成骨細(xì)胞的影響 </p><p>　　2.4.1 成骨細(xì)胞的貼壁率：培養(yǎng)10 h后成骨細(xì)胞的貼壁率為1.125×104/（1.35×104）×100%=83%。 </p><p>　　2.4.2 成骨細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定：每24 h對(duì)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分別進(jìn)行測(cè)定，每次每組測(cè)

20、3孔，連續(xù)測(cè)7 d。測(cè)得成骨細(xì)胞數(shù)值（表1），并繪制成骨細(xì)胞生長(zhǎng)曲線（圖4）。通過對(duì)表1所測(cè)數(shù)值進(jìn)行雙因素方差分析可顯示：各處理組間比較差異有顯著性（Fst1=5.228,Pst1＜0.01）；組內(nèi)不同時(shí)間比較亦有顯著性差異（Fst2=46.696,Pst2＜0.01），但較高煙草浸提液濃度的后5組第4～7天間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。提示煙草浸體液對(duì)成骨細(xì)胞的附著和生長(zhǎng)起抑制作用，且隨其濃度的升高抑制作用增強(qiáng)。表1 成骨細(xì)胞

21、生長(zhǎng)曲線測(cè)定值 </p><p><b>　　3 討論 </b></p><p>　　3.1 成骨細(xì)胞的來源、分離及培養(yǎng) 成骨細(xì)胞的培養(yǎng)方法有兩種：酶消化法和組織塊法。酶消化法是通過用膠原酶和胰蛋白酶處理組織塊來收集細(xì)胞，此法可獲得大量細(xì)胞，但有細(xì)胞膜損害大、細(xì)胞死亡率高、體外活力差等缺點(diǎn)［5］ 。組織塊法則是通過骨組織塊的培養(yǎng)來收集成骨細(xì)胞的，此法簡(jiǎn)便、可靠，

22、但需時(shí)長(zhǎng)、產(chǎn)出率低、含成纖維細(xì)胞較多。本實(shí)驗(yàn)采用先對(duì)組織塊進(jìn)行酶消化，然后再對(duì)組織塊進(jìn)行培養(yǎng)，從而使獲得的成骨細(xì)胞純度較高、細(xì)胞損害小。實(shí)驗(yàn)中成骨細(xì)胞原代培養(yǎng)的關(guān)鍵是：酶消化時(shí)間適宜、骨塊去除及時(shí)、傳代適時(shí)、差速貼壁法純化細(xì)胞等。 </p><p>　　3.2 成骨細(xì)胞的生物學(xué)特性 成骨細(xì)胞能利用ALP水解磷酸酯而釋放出無(wú)機(jī)磷，其基質(zhì)小泡可釋放鈣離子、合成和分泌膠原纖維、糖蛋白等類骨質(zhì)成份從而具有了鈣化能力

23、。因而，成骨細(xì)胞的鑒定目前主要包括了形態(tài)學(xué)觀察、ALP活性、礦化結(jié)節(jié)測(cè)定等［6］。形態(tài)學(xué)觀察，在光鏡下可見貼壁后的成骨細(xì)胞主要呈梭形或三角形，胞核居中或偏于一側(cè)，突起2～4個(gè)，并具有復(fù)層生長(zhǎng)現(xiàn)象。細(xì)胞化學(xué)法則顯示其堿性磷酸酶染色為陽(yáng)性。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)出現(xiàn)聚集、多層重疊現(xiàn)象時(shí)，顯微鏡下可見多個(gè)大小不等的不透明區(qū)域，茜素紅染色則呈陽(yáng)性，證實(shí)其為鈣化結(jié)節(jié)，進(jìn)一步證明所培養(yǎng)細(xì)胞為成骨細(xì)胞。 </p><p>　　3.3 煙

24、草浸提液對(duì)成骨細(xì)胞的影響 煙草中已確認(rèn)的成分有4000多種，其中氮、氧、CO2約占煙霧的85%，其它則包括一些有毒物質(zhì)如尼古丁、鎘、羥基醌、硫氰酸鹽、CO、亞硝胺等。至于煙草對(duì)成骨細(xì)胞的作用，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明煙霧能引起鼠骨小梁體積及表面礦化程度的下降，而骨小梁的礦化程度與成骨細(xì)胞的作用是密切相關(guān)的；體外實(shí)驗(yàn)也曾證明煙草確能破壞成骨細(xì)胞的增殖、分化和功能［7］。本實(shí)驗(yàn)分對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組兩組進(jìn)行，在成骨細(xì)胞加入培養(yǎng)板上培養(yǎng)10 h后測(cè)其附著率為

25、83%。而后在對(duì)照組僅更換培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組則加入不同濃度的煙草浸提液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后測(cè)其細(xì)胞附著與開始時(shí)的相對(duì)比率，對(duì)照組為118%，實(shí)驗(yàn)組按其煙草濃度由低到高分別為115%、89%、74%、63%、52%、34%、29%；由對(duì)照組和低濃度實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞附著率的略有增加可見,細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)開始后有繼續(xù)貼壁生長(zhǎng)的趨勢(shì)，但煙草浸提液對(duì)其生長(zhǎng)確有抑制作用。細(xì)胞的生長(zhǎng)分為潛伏期、指數(shù)期、靜止期三期［8］。實(shí)驗(yàn)也顯示，成骨細(xì)胞在前3 d生長(zhǎng)緩慢，即處在

26、潛伏期。第4天起細(xì)胞生長(zhǎng)速度加快，對(duì)照組、0.8 g/L和1.6 g/L組尤其明顯，此即為指數(shù)生長(zhǎng)期。通過對(duì)</p><p><b>　　【參考文獻(xiàn)】 </b></p><p>　　1］ 尹美珍，李世普，袁琳. 用多次酶消化法體外培養(yǎng)的大鼠成骨細(xì)胞及其鑒定［J］.生物骨科材料與臨床研究，2005，2(5)：1517. </p><p>　?。?/p>

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