透骨消痛膠囊對(duì)TNF-α抑制成骨細(xì)胞增殖、分化的干預(yù)作用研究.pdf

1、目的:
　　 研究透骨消痛膠囊對(duì)TNF-α抑制成骨細(xì)胞增殖、分化的干預(yù)作用，探討藥物對(duì)成骨細(xì)胞成骨功能的調(diào)節(jié)作用，以利于深入研究透骨消痛膠囊對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨下骨骨重建的調(diào)節(jié)作用。
　　 方法:
　　 1透骨消痛膠囊對(duì)TNF-α抑制成骨細(xì)胞增殖的干預(yù)實(shí)驗(yàn)
　　 1.1采用MTT法篩選藥物干預(yù)的最佳條件。
　　 1.2實(shí)驗(yàn)分組:據(jù)篩選的藥物干預(yù)濃度，分正常對(duì)照組、TNF-α組、TNF-α+藥物（低、中、

2、高）組。
　　 1.3指標(biāo)檢測(cè)
　　 (1) MTT檢測(cè)各組細(xì)胞的OD值。
　　 (2)形態(tài)學(xué)觀察:①倒置顯微鏡觀察，比較正常組、TNF-α組、藥物組顯微形態(tài)變化;②PI/Hoechst雙染激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，比較各組細(xì)胞死亡率;③透射電鏡觀察各組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。
　　 2透骨消痛膠囊對(duì)TNF-α抑制成骨細(xì)胞分化的干預(yù)實(shí)驗(yàn)
　　 2.1實(shí)驗(yàn)分組:分成正常對(duì)照組、TNF-α組、TNF-α+藥

3、物組。
　　 2.2指標(biāo)檢測(cè)
　　 (1)堿性磷酸酶（AKP）活性與骨鈣素(OCN)含量:分別取藥物干預(yù)后2、4、6、8、10、12、14天細(xì)胞上清，生化分析AKP活性、ELISA檢測(cè)OCN含量。
　　 (2)特殊染色觀察礦化結(jié)節(jié):①茜素紅染色，光鏡觀察各組礦化結(jié)節(jié)的形成情況;②四環(huán)素?zé)晒鈽?biāo)記，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，比較各組礦化結(jié)節(jié)的形成情況。
　　 (3)掃描電鏡觀察礦化結(jié)節(jié)及原位定量分析Ca元素:

4、①掃描電鏡觀察礦化結(jié)節(jié)及鈣質(zhì)分泌，比較各組的礦化結(jié)節(jié);②采用能譜分析儀對(duì)礦化結(jié)節(jié)進(jìn)行Ca元素原位定量分析，比較各組在200倍、相同面積下Ca元素含量;并在5000倍下比較各組單細(xì)胞及其周圍的Ca元素含量。
　　 結(jié)果:
　　 1.透骨消痛膠囊對(duì)TNF-α抑制成骨細(xì)胞增殖的干預(yù)作用
　　 1.1藥物干預(yù)最佳條件的選擇:藥物1.25mg/ml時(shí)細(xì)胞的OD值最高;在該劑量下藥物干預(yù)24h時(shí)細(xì)胞增值率最大。
　　

5、 1.2細(xì)胞增殖的MTT檢測(cè):與TNF-α組比較，各藥物組的OD值較大，并以中劑量組(1.25mg/ml)最大，提示了藥物可降低TNF-α對(duì)成骨細(xì)胞增殖的抑制作用。
　　 1.3細(xì)胞增殖的倒置顯微鏡觀察:TNF-α組細(xì)胞胞體變小、收縮，多數(shù)細(xì)胞變圓、漂浮，細(xì)胞大量死亡;各藥物組細(xì)胞形態(tài)明顯改善，以中劑量組(1.25mg/ml)細(xì)胞狀態(tài)最好，說明了藥物對(duì)成骨細(xì)胞增殖的保護(hù)作用。
　　 1.4成骨細(xì)胞死亡率的激光共聚焦顯微鏡

6、觀察與分析:TNF-α組細(xì)胞死亡率達(dá)55.07％，而藥物組細(xì)胞死亡率明顯減少為18.68％，說明了藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的保護(hù)作用。
　　 1.5成骨細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的透射電鏡觀察:TNF-α組多數(shù)細(xì)胞核內(nèi)異染色質(zhì)聚集，核膜鼓起，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、核糖體脫落，線粒體固縮，提示這些細(xì)胞已變性、壞死;部分細(xì)胞收縮，核染色質(zhì)高度凝聚，核碎裂，細(xì)胞凋亡;而藥物組多數(shù)細(xì)胞的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)等細(xì)胞器明顯改善。這些提示了藥物對(duì)TNF-α誘導(dǎo)成骨細(xì)胞損傷的改善作用

7、。
　　 2.透骨消痛膠囊對(duì)TNF-α抑制成骨細(xì)胞分化的干預(yù)作用
　　 2.1成骨細(xì)胞分化早期標(biāo)志（AKP活性）、分化晚期標(biāo)志（OCN含量）的檢測(cè):與TNF-α組比較，藥物作用2天后，就可促進(jìn)AKP活性、OCN含量的升高，6天后其促進(jìn)作用更明顯，提示了藥物可促進(jìn)成骨細(xì)胞早、晚期分化，并可降低TNF-α對(duì)成骨細(xì)胞分化的抑制作用。
　　 2.2成骨細(xì)胞分化成熟標(biāo)志（礦化結(jié)節(jié)）的特殊染色觀察:茜素紅與四環(huán)素染色均發(fā)現(xiàn)結(jié)

8、果顯示，TNF-α組未形成礦化結(jié)節(jié)，而藥物組可形成礦化結(jié)節(jié)，說明藥物可促進(jìn)成骨細(xì)胞分化成熟。
　　 2.3礦化結(jié)節(jié)的掃描電鏡觀察及其Ca元素的原位定量分析:掃描電鏡下，TNF-α組無礦化結(jié)節(jié)，而藥物組可見礦化結(jié)節(jié)。通過Ca元素原位定量的能譜分析顯示，藥物組的Ca元素?zé)o論在低倍或在高倍（單細(xì)胞及其周圍）中均較TNF-α組高。這進(jìn)一步說明藥物可促進(jìn)成骨細(xì)胞鈣質(zhì)分泌。
　　 結(jié)論:
　　 1.透骨消痛膠囊能促進(jìn)成骨細(xì)胞