透骨消痛膠囊調(diào)控miRNAs抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨基質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　探討透骨消痛膠囊調(diào)控miRNAs抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨基質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.2月齡SPF級SD雄性大鼠30只，隨機(jī)數(shù)字表分組法將實(shí)驗(yàn)大鼠分為空白組(10只，行假手術(shù)后生理鹽水10 mL/kg、1次/日灌胃)、模型組（10只，改良Hulth法造模后生理鹽水10 mL/kg、1次/日灌胃）、透骨消痛膠囊組（10只，改良Hulth法造模后透骨消痛膠囊10 mL/kg、1次/日灌胃），連續(xù)灌胃治療

2、12周后取材。關(guān)節(jié)軟骨整體形態(tài)觀察，HE染色觀察關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，甲苯胺藍(lán)染色觀察關(guān)節(jié)軟骨中蛋白多糖變化，ELISA檢測滑膜組織中IL-1β、TNF-α、MMP-13表達(dá)。
　　2.4周齡SPF級SD雄性大鼠10只，機(jī)械-Ⅱ型膠原酶消化法分離提取大鼠軟骨細(xì)胞，Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色、甲苯胺藍(lán)染色對軟骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定，建立大鼠軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)。ELISA檢測IL-1β、TNF-α確立LPS誘導(dǎo)建立炎癥性軟骨細(xì)胞模型的條件，透骨消

3、痛膠囊干預(yù)濃度。體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，分為空白組、模型組(10 ng/ml LPS)、抑制劑組（10μmol/ml SB203580干預(yù)30min后加入10 ng/ml LPS）、透骨消痛膠囊組(10ng/ml LPS+300μg/ml透骨消痛膠囊)，干預(yù)8h。
　　ELISA檢測各組軟骨細(xì)胞上清液中IL-6、MMP-9、TIMP-1表達(dá)量，QRT-PCR檢測各組軟骨細(xì)胞miRNA-140、miRNA-27b、miRNA-146a表達(dá)

4、，Western-blot檢測各組軟骨細(xì)胞p-p38 MAPK、p38 MAPK、MMP-13、MMP-3、ADAMTS4、ADAMTS5表達(dá)，免疫熒光染色觀察各組軟骨細(xì)胞p-p38 MAPK、p38 MAPK、MMP-3、ADAMTS4表達(dá)，QRT-PCR檢測各組軟骨細(xì)胞p38 MAPK、MMP-13、MMP-3、ADAMTS4、ADAMTS5表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.膝關(guān)節(jié)滑膜組織中IL-1β、TNF-α、MMP-13

5、表達(dá)，模型組明顯高于空白組(P＜0.05、P＜0.01)，透骨消痛膠囊組明顯低于模型組（P＜0.05、 P＜0.01），透骨消痛膠囊組與空白組之間無明顯差異(P＞0.05)。甲苯胺藍(lán)染色顯示空白組大鼠關(guān)節(jié)軟骨染色較深且均勻，模型組出現(xiàn)大范圍失染，透骨消痛膠囊組染色深淺介于空白組和模型組之間。HE染色顯示空白組大鼠關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)完整，軟骨細(xì)胞排列整齊，未見軟骨細(xì)胞肥大分化。模型組關(guān)節(jié)軟骨表面局部粗糙不平，軟骨層變薄，軟骨細(xì)胞裸露、排列絮亂、

6、出現(xiàn)肥大分化現(xiàn)象。透骨消痛膠囊組關(guān)節(jié)軟骨淺表層基本完整，層次清晰可辨，軟骨細(xì)胞狀態(tài)介于空白組與模型組之間?？瞻捉M關(guān)節(jié)軟骨整體形態(tài)完整，模型組關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)明顯破損、關(guān)節(jié)周圍有骨贅形成，透骨消痛膠囊組關(guān)節(jié)軟骨整體相對完整、未見骨贅形成。
　　2.脂多糖誘導(dǎo)炎癥性軟骨細(xì)胞模型建立條件確定為10 ng/mL干預(yù)8h，透骨消痛膠囊干預(yù)濃度確定為300μg/mL。軟骨細(xì)胞上清液MMP-9、IL-6的表達(dá)模型組高于空白組(P＜0.05、P＜0.

7、01)，透骨消痛膠囊組低于模型組（P＜0.05、P＜0.01）。軟骨細(xì)胞上清液TIMP-1的表達(dá)，模型組低于空白組(P＜0.05)，透骨消痛膠囊組顯著高于模型組(P＜0.01)。軟骨細(xì)胞miRNA-140、miRNA-27b的表達(dá)，模型組顯著低于空白組(P＜0.01)，透骨消痛膠囊組顯著高于模型組(P＜0.01)。軟骨細(xì)胞miRNA-146a的表達(dá)，模型組顯著高于空白組(P＜0.01)，透骨消痛膠囊組低于模型組(P＜0.05)。軟骨細(xì)胞

8、MMP-3、MMP-13、ADAMTS4、ADAMTS5、p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白的表達(dá)，模型組高于空白組(P＜0.05、P＜0.01)，透骨消痛膠囊組低于模型組(P＜0.05)。軟骨細(xì)胞MMP-3、MMP-13、ADAMTS4、ADAMTS5、p38 MAPK基因的表達(dá)，模型組高于空白組(P＜0.05、P＜0.01)，透骨消痛膠囊組低于模型組(P＜0.05、P＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　1.透骨消痛膠